Neuralrörsdefekter Stängning på Mus Hela Embryo Culture

Summary

En metod som ger direkt farmakologisk manipulation av musembryon under neurulation som kringgår moderns ämnesomsättning beskrivs. Tekniken kan anpassas för att studera olika aspekter av neurulation genom att variera tidpunkten och farmakologiska agent.

Abstract

Genetiska musmodeller är ett viktigt verktyg i studien av däggdjur neuralrörsdefekter stängning (Gray & Ross, 2009; Ross, 2010). Dock är studiet av musembryon i livmodern begränsad av vår oförmåga att direkt farmakologiskt manipulera embryon i isolerade från effekterna av moderns metabolism på reagens av intresse. Oavsett om du använder en liten molekyl, rekombinant protein, eller siRNA, leverans av dessa ämnen till mamman, genom kosten eller genom injektion kommer att underkasta dessa instabila föreningar till en mängd olika kroppsliga försvar som kan hindra dem från att nå embryot. Undersökningar i kulturer av hela embryon kan användas för att skilja moderns från inneboende fostrets effekter på utvecklingen.

Här presenterar vi en metod för embryon odling musen med höganrikat media i en rulle inkubator apparat som möjliggör normala neuralrörsdefekter stängning efter dissektion (Crockett, 1990). En gång i kultur, embryon kanmanipuleras med hjälp av konventionella in vitro-tekniker som annars inte skulle vara möjligt om de embryon fortfarande var i livmodern. Embryo syskon kan samlas in vid olika tidpunkter för att studera olika aspekter av neurulation, som inträffar från E7-7,5 (neurala plattan bildning, strax före inledandet av neurulation) till E9.5-10 (i slutet av kraniala gånger och stjärtfenan neuropore stängning, Kaufman, 1992). I detta protokoll, visar vi vår metod för att dissekera embryon vid tidpunkter som är optimala för att studera kraniella neurulation. Embryon kommer att dissekeras på E8.5 (ca 10-12 somities), efter inledandet av neuralröret stängning men innan embryot svarvning och kraniella neuralvall stängning, och hållas i kultur till E10 (26-28 somities), när kraniala neurulation ska vara komplett.

Protocol

1. Beredning av kultur medier - alla reagenser är listade i tabell 1

1. Tina hanråtta serum vid 37 ° C.
2. Värme-Inaktivera råtta serum i 30 minuter vid 55 ° C
3. Centrifugera råtta serum på 10K i 5 minuter i rumstemperatur
4. Avlägsna supernatanten och blanda 50:50 med fenol-röd gratis DMEM w / höga glukos
5. Sterilisera media med hjälp av en 0,45 um sprutfilter
6. Minst 1 ml media / embryo bör förberedas

2. Isolering av livmodern från den gravida dammen

1. Med hjälp av förfaranden som godkänts av Institutional Animal Care och användning kommittén (IACUC), är gravid dammen first sövda och sedan offrade av halsdislokation
2. Sterilisera buken med 70% EtOH
3. Nyp en liten stig i huden längs med mittlinjen, precis ovanför bröstvårtan linjen, med stora pincett och öppna buken under din pincett med stora saxar. Var försiktig så du inte skadar någon inre strukturs
4. Använd din sax för att klippa sidled från den ursprungliga öppning mot varje sida av musen så att hela buken är öppen
5. Tarmar och överflödigt fett kuddar kan ofta obskyra livmodern och dessa bör flyttas åt sidan så att den övre delen av livmodern och äggstockarna kan observeras på varje sida
6. Nyp toppen av livmodern under äggstockarna och använda sax för att skilja livmodern från fett, skära från ena änden av livmodern till den andra äggstocken
7. Lyft ur livmodern med din tång och lägg i en petriskål med koksaltlösning

3. Borttagning av embryon från livmodern

1. Skölj livmodern med saltlösning för att ta bort överflödigt blod och trimma överflödigt fett från utsidan
2. Överför till en ren skål med rumstemp. Tyrodes saltlösning för att förbättra visualisering
3. Använda ett stereomikroskop, separera varje embryo med hjälp av antingen en liten sax eller vid behov fina (# 5) pincett för att försiktigt skala livmodern isär.
<li> Infoga fin pincett i utrymmet mellan livmoderväggen och decidua och dra tillbaka livmoderväggen, försiktigt så att inte pierca embryot

4. Borttagning av decidua från embryon

1. Orientera decidua så att den mörkare delen (moderkakan) är vänd bort från dig
2. Gör ett snitt med din tång längs linjen som skiljer den mörka delen av decidua från den lättare delen, var noga med att inte skära för djupt
3. Komplett separation av moderkakan från toppen av gulesäcken, försiktigt så att inte riva ectoplacental konen (EPC). Vid det här laget bör du kunna visualisera Reicherts membranet på gulesäcken
4. Fortsätt att ta bort hela decidua (ljusare delen) försiktigt så att inte tränga igenom gulesäcken
5. Nyp försiktigt tag och ta bort Reicherts genom att dra bort den från EPC. Om EPC är skadad eller skiljs från gulesäcken kommer embryon misslyckas med att vända normalt från E8.5-E9.5

5. Inställning av kultur-systemet

1. Skär i slutet av en plast överföringspipett med en sax för att öka diametern på öppningen så att ett embryo kan pipetteras utan att skada gulesäcken
2. Fyll rena berg-flaskor med 1 ml av media per embryo. Beroende på vilken typ av vält flaskor som används högst 3-6 embryon kan laddas i varje flaska.
3. Överför embryon med hjälp av klipp pipett till media-fylld rulle flaska, föra över så lite Tyrodes som möjligt för att inte späda media
4. Montera gummipluggen (propp) till toppen av glaset rulle flaskan
5. Sätt rullen flaskor till rullen kultur trumman så att en tät försegling bildas mellan stickkontakten och trumman
6. När alla flaskor har fäst och eventuella tomma platser i trumman har förseglats wed gummiproppar, aktivera rullen
7. Öppna CO ₂ och O ₂ tankar och justera dem till cirka 2 psi, så att ventilen släpper en bubbla per sekund. För E8.5-E10 embryon, bör 20% O ₂ och 5% CO ₂ användas.
8. Se till att inkubatorn är inställd på 37 ° C och täck eller stänga kuvös så att embryona skyddas från ljus.
9. Embryon bör kontrolleras regelbundet för att bedöma deras utveckling genom tillsats av somities, utvecklingen av svarvning, och omfattningen av neuralrörsdefekter stängning
10. Efter 2-3 timmar i kultur kan farmakologiska hämmare eller andra behandlingar läggas till media
11. Studiens utformning bör inkludera kontroller, till exempel fordon eller inaktiva analoger av studie reagens.

6. Utvärdering av utvecklingen efter hela embryo kultur

1. Stäng av gasen, stanna rullen, och ta bort flaskorna från inkubatorn
2. Överför embryon tillbaka till Tyrodes eller PBS i en petriskål för utvärdering inom stereomikroskop
3. Gulesäcken ska visas ballong-liknande, ett hjärtslag ska vara synliga och hjärtfrekvens ska vara> 120 slag per minut, och cirkulation bör framgå
4. Foto embryon innan gulesäcken bort om det behövs
5. Ta bort gulesäcken från embryo genom att klippa ett hål nära EPC och vrida gulesäcken och amnion över huvudet och bakdel av embryot.
6. Navelsträngen kan klippas till separata gulesäcken från embryot, och gulesäcken kan användas för genotypning embryot om det behövs.
7. Undersök embryon för somit nummer och neuralrörsdefekter, till exempel öppna kraniell veck, ofullständig slutning av ansikte och / eller ett öppet stjärtfenan neuropore. Embryon kan arrangeras enligt Theiler klassificeringen av flera morfogenetiska förändringar ( http://www.emouseatlas.org/ eMap / home.html ) Återigen, ett fotografi avembryots utveckling är användbar.

7. Anteckningar

1. En hög kvalitet dissektion är viktigt, eftersom en nick eller tårar i gulesäcken kommer att hindra framgångsrik svarvning och hämmar normal utveckling. EPC kan också skadas vid avlägsnande av Reichert membran (RM), och om EPC är ännu delvis separeras från gulesäcken kommer embryon som inte utvecklas normalt. Kan dock ofullständig borttagning av RM orsaken embryon som håller ihop och / eller RM celler kan växa över i kultur och tygla gulesäck expansion, som båda skulle hindra en normal utveckling.
2. Ren och skarp pincett är hemligheten till att få en bra dissektion, eftersom matt eller böjd peang göra förfarandet betydligt svårare. Protein insättningar på instrument kommer att leda till vävnadsskador.
3. Ren, steril glasflaskor är också viktigt att förhindra embryon fastnar på sidan väggen och skadas. Innan du startar experimentet bör flaskorna vara scrubbed med tvål och vatten, sköljas i dH ₂ O, och mikrade med en liten mängd vatten i varje flaska tills vattnet kokar. Flaskor sedan sköljs med 70% EtOH och får lufttorka.
4. Arbeta så snabbt som möjligt, eftersom ju tidigare embryot kan överföras till kultur media och uppvärmd till 37 ° C desto bättre överlevnad.
5. Fyll dissekera hela kullen innan du överför några embryon till rulle flaskor så att varje embryo är i rumstemperatur för samma tid för att undvika eventuella avvikelser i embryots tillväxt
6. Behåll en steril miljö för att förhindra bakteriell förorening av kulturer. Vår kultur experiment har utförts utan antibiotika, men många laboratorier lägga antibiotika till sina medier för att förhindra bakterietillväxt. Mediet ska visas som klart vid slutet av experimentet som det var i början av experimentet. Om media har blivit grumlig eller finns det en synlig fällning, kommer det troligtvis en konkontaminering som har smittat er kultur.
7. Ineffektiva gasutbyte kan också försena embryon utveckling, så se till att ha en pålitlig regulator som kommer att säkerställa kontinuerlig leverans.
8. Embryon utvecklas ungefär 50% långsammare i ex vivo-kulturen, därför är det viktigt att räkna somites att se till att du har nått rätt skede av utveckling för genomförandet av experimentet.

8. Representativa resultat:

Utseendet på embryon före och efter-roller kultur illustreras i figur 1. Vid tidpunkten för dissektion bör embryon vara i en ovänd konfiguration (Fig. 1A, D) där svansen är bakom huvudet veck. Efter 36 timmar i kultur, embryon har genomgått vrida så att de är i C-böjd, fosterställning, där svansen är framför huvudet (Fig. 1B, C, E, F). Farmakologisk manipulation med RhoA kinas-hämmare (Y-27.632), en känd hämmare av konvergerande förlängning underneurulation (Ybot-Gonzalez, 2007), resulterar i en förkortning av embryon längs rostralt-caudal axeln (Fig. 1E, F) och hämmar kraniella neurala gånger stängning. Våra data visar att ökande doser av Y-27.632 successivt försämrar kraniell gånger stängning (Figur 2A) och förkortar kroppen axeln (Fig. 2B), överensstämmer med dess roll i efterföljande RhoA signalering i kraniella neurulation och konvergerande förlängning.

Figur 1. Utseende av kulturer embryon och manipulation med den farmakologiska hämmare Y-27.632. (A, D) dissekerade embryon vid E8.5 innan hela embryo kultur (B, E) Embryon på E10 med gulesäcken fortfarande intakt, efter 36hrs av rulle kultur. (C, F) gulesäcken har tagits bort för att illustrera framgångsrika svarvning och neuralrörsdefekter stängning. Embryon som behandlades med den Rho kinas-hämmaren Y-27.632 (E, F) underlåtit att genomgå ordentlig konvergent förlängning och illustreraen kortare kropp axel.

Figur 2. Verkan av RhoA kinas-inhibitor på kranial neuralrörsdefekter stängning och axel töjning. (A) Andelen embryon som lyckades att stänga sina kraniell veck (% NTC = procent neuralrörsdefekter stängning) jämförs med den dos av Y-27.632 läggas till kultur media. (B) Avståndet mellan öron vesikler och forelimb kraftigt nedsatt vid ökande doser av Y-27.632 (p <0,05).

Discussion

Förmågan att skilja moderns, intrauterin faktorer från de som är inneboende i embryot under dess utveckling är ett viktigt verktyg för att studera alla stadier av fosterutveckling. Här har vi analyserat effekterna av en liten molekyl hämmare av RhoA kinas på kranial neurulation ex utero, och därmed undanröja den rörliga av moderns metabolism av läkemedlet. Detta farmakologisk manipulation har en djupgående effekt på kraniala neurulation och konvergerande förlängning. Känsligheten för denna förening kan jämföras mellan olika genetiska musen mutanter. Metoden som presenteras här kan också tillämpas på studier av andra molekylära vägar i utvecklingen, vilket gör att direkt manipulation av cellulär funktion i embryon med hjälp av olika reagenser.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Stereomicroscope for Dissection	Leica Microsystems	M165
Precision Incubator	BTC Engineering	BTC 001
Rotating Bottle Culture Unit	BTC Engineering	BTC 003
Glass Bottles for Rotating Unit	BTC Engineering	BTC 005
Silicone Rubber Bung	BTC Engineering	BTC 007
Silicone Rubber Cork	BTC Engineering	BTC 008
Gas Bubbler Inlet	BTC Engineering	BTC 012
Gas Bubbler Inlet Trap	BTC Engineering	BTC 013
Gas Bubbler Outlet	BTC Engineering	BTC 014
Gas Cylinder	Tech Air		20% O2, 5% CO2
Gas Regulator	Tech Air
Male Rat Serum	Harlan Laboratories	4520
DMEM w/o phenol red	Invitrogen	31053
10 mL Syringe	BD Biosciences	309604
Syringe Filter	Nalge Nunc international	190-2545
Large Dissecting Scissors (Blunt tip)	VWR international	82027-594
Extra Fine Bonn Scissors	Fine Science Tools	14084-08
Dumot #5 forceps	Fine Science Tools	11252-50
Tyrode’s Saline			As described in Cockroft 1990
10 cm Disposable Petri Dish	BD Biosciences	351029