Summary
允许直接药理操纵小鼠胚胎神经胚绕过产妇代谢的方法描述。可适应的技术，来研究神经胚形成的不同方面，不同的时间点和药理代理人。
Abstract
遗传小鼠模型是研究哺乳动物的神经管闭合的重要工具（灰色和罗斯，2009年，罗斯，2010）。然而，小鼠胚胎在子宫内的研究是有限的，我们无法直接药理操纵试剂利益产妇代谢的影响，在隔离的胚胎。一个小分子，重组蛋白，或siRNA，这些物质传递的母亲，无论是通过饮食或注射使用将受这些不稳定的化合物，以各种身体的防御系统，可以防止他们到达胚胎。全胚胎培养的调查，可用于单独的产妇从发展的内在胎儿的影响。
在这里，我们目前培养小鼠胚胎滚筒孵化设备，允许正常解剖后神经管闭合“（克罗克特，1990年）在使用高浓缩铀的媒体的方法。一旦在文化，胚胎可以被操纵在体外培养技术，否则不会有可能的， 如果胚胎在子宫内仍然使用传统。胚胎的兄弟姐妹可以在不同时间点收集，研究不同方面的神经胚发生，E7 - 7.5（神经板的形成，神经胚启动前）E9.5 - 10（颅倍和尾鳍neuropore结束封闭，考夫曼，1992年）。在这个协议中，我们展示了解剖胚胎颅神经胚形成的研究最佳的时间点，我们的方法。胚胎将被解剖E8.5（约10-12 somities），神经管闭合后启动，但前胚胎车削和颅神经倍关闭，并在文化一直维持到E10（26-28 somities），当颅神经胚应该是完整的的。
Protocol
1。培养基的制备 - 所有试剂都列于表1
- 解冻雄性大鼠血清在37 ° C。
- 热灭活30分钟大鼠血清在55 ° C
- 离心机在10K大鼠血清在室温下5分钟
- 免费酚红的DMEM /高糖取出上清和混合50:50
- 使用0.45微米注射器过滤消毒媒体
- 至少应做好媒体/胚胎1毫升
2。从怀孕坝子宫隔离
- 使用机构的动物护理和使用委员会（IACUC）的批准程序，怀孕的大坝是先麻醉，然后由颈椎脱位处死
- 消毒用70％乙醇的腹部
- 捏一小块皮肤路径，沿中线乳头线以上，与大钳和开放的大剪刀钳下方的腹部。要小心，不要破坏任何内部结构小号
- 使用剪刀横向减少对鼠标两侧的初始开放，使整个腹部开放
- 肠子和多余的脂肪垫，往往可以掩盖子宫，这些应该被移到搁置，子宫和卵巢的顶部，可以在每边观察
- 捏低于卵巢子宫顶部，并用剪刀从脂肪中分离出来的子宫，子宫的一端切割到其他卵巢
- 电梯在培养皿中，用生理盐水子宫钳和地点
3。去除胚胎从子宫
- 用生理盐水冲洗子宫，以消除任何多余的血液和修剪任何多余的脂肪从外面
- 转移到一个干净菜室温。 Tyrodes生理盐水以改善可视化
- 使用立体显微镜，单独使用或如有必要，罚款或者小剪刀钳（＃5）每个胚胎剥离子宫除了仔细。 <李>插入的子宫壁和蜕膜和剥离子宫壁之间的空间精细镊子，小心不要刺破胚胎
4。从胚胎中去除蜕膜
- 东方蜕膜，使较暗的部分（胎盘）正面临着远离你
- 沿较轻的部分分离蜕膜暗部分与您钳切口，注意不要剪得太深
- 完成从卵黄囊顶部的胎盘分离，小心不要撕破ectoplacental锥（EPC）。此时，你应该能够看到卵黄囊Reicherts膜
- 继续清除不小心捅破卵黄囊整个蜕膜（较轻的部分）
- 轻轻一捏，从EPC脱皮删除Reicherts。如果EPC损坏或从卵黄囊分离，胚胎将无法正常打开E8.5 - E9.5
5。设立文化系统
- 剪下一个塑料移液管，用剪刀增加开放的直径，使胚胎可以在不损害卵黄囊吸管
- 填写1毫升每胚胎媒体清洁滚瓶。根据滚瓶型使用最多3-6胚胎可以装载在每个瓶子。
- 传输使用切吸管媒体充满滚瓶，尽可能少Tyrodes超过的胚胎，以免冲淡媒体
- 将玻璃辊瓶橡胶塞（塞）
- 插入辊文化鼓滚瓶，密封插头和鼓之间形成
- 一旦所有的瓶子都受到高度重视，并在任何鼓空槽已密封瓦特第i个橡胶瓶塞，激活滚筒
- 打开CO 2和O 2坦克，约2 PSI调整，使出口阀是每秒释放一个泡沫。 E8.5 - E10的胚胎，20％O 2和5％的CO 2，应使用。
- 确保孵化器的设置为37 ° C和覆盖或关闭的孵化器，使胚胎从光屏蔽。
- 应定期检查胚胎的somities此外，转弯的进展，和神经管闭合的程度，以评估其发展
- 经过2-3小时，在文化，药理抑制剂或其他治疗，可以添加到媒体
- 研究设计应包括控制，如车辆或类似物的研究试剂无效。
6。评估后全胚胎培养的发展
- 关闭煤气，停止辊，从孵化器中删除瓶
- 转移胚胎到台氏在评价体视显微镜下的培养皿或PBS
- 卵黄囊应该会出现气球样，心跳应该是可见的的和心率应每分钟120次，流通，应明显
- 如有必要，照片胚胎卵黄囊删除前
- 从胚胎中取出切割孔附近的EPC和翻转，头部和臀部的胚胎卵黄囊和羊膜卵黄囊。
- 切断脐带，可以从胚胎中分离出来的卵黄囊，卵黄囊可用于基因分型的胚胎，如果有必要的。
- 检查胚胎体节数和神经管缺陷，如开放的颅褶皱，不完全封闭的脸和/或一个开放的尾鳍neuropore的，。胚胎可以根据Theiler多个形态发生变化的分类（http://www.emouseatlas.org/ EMAP / home.html做为）同样，一个摄影记录上演胚胎发育是有益的。
7。注释
- 一个高品质的夹层是必要的，因为任何划痕或卵黄囊的泪水会阻止成功的转折点和抑制的正常发展。也可以被损坏的EPC在拆除赖克特的膜（RM），如果EPC甚至部分从卵黄囊分离，胚胎不能正常发育。然而，不完全切除的RM可引起胚胎粘在一起和/或RM细胞可长满文化和收缩卵黄囊的扩张，这两个会妨碍正常的发展。
- 清洁和锋利的钳，获得良好的解剖秘密，因为沉闷或弯曲钳使程序明显更加困难。文书上的蛋白质沉淀，会导致组织损伤。
- 清洁，无菌的玻璃瓶也是必不可少的，以防止坚持侧壁和被破坏胚胎。在实验开始之前，瓶应SCRubbed用肥皂和水，在DH 2 O冲洗，并在每个瓶子的水，直到水沸腾的少量微波。瓶，然后用70％乙醇冲洗，并允许空气干燥。
- 尽可能快地工作，因为胚胎迟早可以转移到文化传媒和温暖至37 ° C的更好的生存。
- 完成解剖任何胚胎转移前滚瓶的整个的垃圾，使每个胚胎在室温下是相同的时间量，以避免造成任何差异在胚胎发育
- 保持无菌的环境，以防止细菌污染的文化。我们的文化实验已经执行无抗生素，但许多实验室自己的媒体中添加抗生素，以防止细菌生长。媒介应该出现在实验结束后，在实验开始时一样清楚。如果媒体已变得混浊或有一个可见的沉淀，有可能是一个CON混染，感染了你的文化。
- 无效的气体交换，也可以延迟胚胎的发育，所以要确保有一个可靠的稳压器，确保连续投放。
- 胚胎发育在体外培养慢约50％，因此，它是必不可少的计数体节，以确保您已达到适当的发展阶段，为完成实验。
8。代表性的成果：
前胚胎的外观和后滚子文化是如图1所示。在解剖时，应千方百计配置（图1A，D）的尾巴后面的头部皱褶胚胎。在培养36小时后，胚胎应该有完成的转折点，使他们在C型弯曲，胎儿的位置，尾巴在前面的头（图1B，C，E，F）。 RhoA蛋白激酶抑制剂（Y - 27632），收敛扩展已知的抑制剂在药理操纵神经胚（Ybot - 冈萨雷斯，2007年），缩短沿喙尾椎轴（图1E，F）的胚胎和抑制颅神经倍封闭的结果。我们的数据显示，逐步增加剂量的Y - 27632损害颅折封（图2A），并缩短身体的纵轴（图2B），下游RhoA的颅神经胚形成和收敛扩展信号的作用是一致的。
图1。文化胚胎和操纵的药理抑制剂Y - 27632的外观。 （A，D）解剖前全胚胎培养胚胎在E8.5（B，E）在E10与卵黄囊仍完好无损，辊培养36小时后的胚胎。 （C，F）卵黄囊已被删除，说明成功的转折和神经管闭合。与Rho激酶抑制剂Y - 27632（E，F）处理的胚胎未能接受适当的收敛延伸，并说明一个体轴缩短。
图2。RhoA蛋白激酶抑制剂对颅神经管闭合和轴伸长。 （一）胚胎的百分比，能够成功地完成其颅褶皱（％NTC =百分比神经管闭合）相比，Y - 27632的剂量添加到培养基。 （二）奥迪囊泡和前肢之间的距离显着减少的Y - 27632剂量的增加（P <0.05）。
Discussion
那些在其发展的内在胚胎分离孕产妇，胎儿宫内因素的能力，是研究胚胎发育的各个阶段的重要工具。在这里，我们的RhoA蛋白激酶对颅神经胚形成前宫内的小分子抑制剂，从而消除产妇代谢药物的变量，分析了影响。这药理操纵对颅神经胚形成和融合扩展产生深远的影响。这种化合物的敏感性，可以比较不同的遗传鼠标突变体。这里介绍的方法也可以适用于其他发展中的分子途径的研究，允许使用的各种试剂的胚胎细胞功能的直接操纵。
Disclosures
没有利益冲突的声明。
Acknowledgments
我们想感谢与解剖和文化技术有益的建议A. Hadjantonakis（斯隆 - 凯特林研究所）的实验室和L. Niswander（科罗拉多州丹佛U）的实验室。这项工作已经支持NRSA NS059562 JDG和RO1NS05897 MER L. Niswander和J.纳多（系统生物学研究所）合作。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Stereomicroscope for Dissection | Leica Microsystems | M165 | |
| Precision Incubator | BTC Engineering | BTC 001 | |
| Rotating Bottle Culture Unit | BTC Engineering | BTC 003 | |
| Glass Bottles for Rotating Unit | BTC Engineering | BTC 005 | |
| Silicone Rubber Bung | BTC Engineering | BTC 007 | |
| Silicone Rubber Cork | BTC Engineering | BTC 008 | |
| Gas Bubbler Inlet | BTC Engineering | BTC 012 | |
| Gas Bubbler Inlet Trap | BTC Engineering | BTC 013 | |
| Gas Bubbler Outlet | BTC Engineering | BTC 014 | |
| Gas Cylinder | Tech Air | 20% O2, 5% CO2 | |
| Gas Regulator | Tech Air | ||
| Male Rat Serum | Harlan Laboratories | 4520 | |
| DMEM w/o phenol red | Invitrogen | 31053 | |
| 10 mL Syringe | BD Biosciences | 309604 | |
| Syringe Filter | Nalge Nunc international | 190-2545 | |
| Large Dissecting Scissors (Blunt tip) | VWR international | 82027-594 | |
| Extra Fine Bonn Scissors | Fine Science Tools | 14084-08 | |
| Dumot #5 forceps | Fine Science Tools | 11252-50 | |
| Tyrode’s Saline | As described in Cockroft 1990 | ||
| 10 cm Disposable Petri Dish | BD Biosciences | 351029 |
References
- Cockroft, D. L. Dissection and culture of post implantation embryos. Mammalian Postimplantation Embryos A Practical Approach. Copp, A. J., Cockroft, D. L. , IRL Press. Oxford. (1990).
- Gray, J. D., Ross, M. E. Mechanistic insights into folate supplementation from Crooked tail and other NTD-prone mutant mice. Birth Defects Res. A. Clin. Mol. Teratol. 85, 314-321 (2009).
- Kaufman, M. H. The Atlas of Mouse Development. , Academic Press Limited. San Diego. (1992).
- Ybot-Gonzalez, P., Savery, D., Gerrelli, D., Signore, M., Mitchell, C. E., Faux, C. H., Greene, N. D., Copp, A. J. Convergent extension, planar-cell-polarity signalling and initiation of mouse neural tube closure. Development. 134, 789-799 (2007).
- Ross, M. E. Gene-environment interactions, folate metabolism and the embryonic nervous system. Wiley Interdiscip Rev Syst Biol Med. 2, 471-480 (2010).
