Fermeture du tube neural dans la culture Mouse Embryo entier

Summary

Une méthode permettant la manipulation pharmacologique directe d'embryons de souris au cours neurulation qui contourne le métabolisme de la mère est décrite. La technique peut être adaptée pour étudier les différents aspects de la neurulation en faisant varier le point dans le temps et l'agent pharmacologique.

Abstract

Modèles génétiques de souris sont un outil important dans l'étude de la fermeture du tube neural chez les mammifères (Gray & Ross, 2009; Ross, 2010). Cependant, l'étude des embryons de souris in utero est limité par notre incapacité à manipuler directement pharmacologiquement les embryons dans l'isolement des effets du métabolisme de la mère sur le réactif d'intérêt. Que ce soit en utilisant une petite molécule, protéine recombinante, ou siARN, la livraison de ces substances à la mère, par l'alimentation ou par injection sous réserve de ces composés instables à une variété de défenses corporelles qui pourraient les empêcher d'atteindre l'embryon. Enquêtes dans les cultures d'embryons de l'ensemble peut être utilisé pour séparer la mère du intrinsèques effets sur le fœtus sur le développement.

Ici, nous présentons une méthode de culture des embryons de souris en utilisant les médias hautement enrichi dans un appareil à rouleaux incubateur qui permet de fermeture du tube neural normale après dissection (Crockett, 1990). Une fois dans la culture, les embryons peuventêtre manipulées en utilisant des techniques in vitro conventionnelle qui ne serait pas possible autrement si les embryons étaient encore dans l'utérus. Frères et sœurs d'embryon peuvent être recueillies à des moments différents pour étudier les différents aspects de la neurulation, survenant de E7-7.5 (la formation de la plaque neurale, juste avant le début de la neurulation) pour E9.5-10 (à l'issue de neuropore plier et caudale du crâne fermeture, Kaufman, 1992). Dans ce protocole, nous démontrons notre méthode pour disséquer des embryons au timepoints qui sont optimales pour l'étude de la neurulation crânienne. Les embryons seront disséqués à E8.5 (environ 10-12 somities), après l'initiation de la fermeture du tube neural, mais avant de tourner l'embryon et de fermeture crânienne neurones pli, et maintenues en culture jusqu'à E10 (26-28 somities), quand crânienne neurulation doit être complète.

Protocol

1. Préparation des milieux de culture - tous les réactifs sont répertoriés dans le tableau 1

1. Sérum de rat mâle dégel à 37 ° C.
2. Chauffer inactiver le sérum de rat pendant 30 min à 55 ° C
3. Sérum de rat Centrifuger à 10K pendant 5 min à température ambiante
4. Retirer 50:50 surnageant et mélanger avec du phénol-rouge w gratuitement DMEM / glucose à haute
5. Stériliser les médias en utilisant un filtre de 0,45 um seringue
6. Au moins 1ml de médias / embryon devrait être préparé

2. Isolement de l'utérus à partir du barrage enceinte

1. En utilisant les procédures approuvées par le soin des animaux et du Comité institutionnel d'utilisation (IACUC), le barrage de grossesse est d'abord anesthésiés puis sacrifiés par dislocation cervicale
2. Stériliser l'abdomen avec 70% EtOH
3. Pincez un petit chemin de la peau le long de la ligne médiane, juste au-dessus de la ligne du mamelon, avec une pince large et ouverte de l'abdomen en dessous de votre forceps avec de grands ciseaux. Soyez prudent de ne pas endommager la structure internes
4. Utilisez vos ciseaux pour couper latéralement de l'ouverture initiale vers les côtés de la souris pour que tout l'abdomen est ouvert
5. Les intestins et l'excès coussinets adipeux peuvent souvent obscurcir l'utérus et ils devraient être écartés pour que le haut de l'utérus et les ovaires peuvent être observées sur chaque côté
6. Pincez le haut de l'utérus ci-dessous les ovaires et l'utilisation de vos ciseaux pour séparer l'utérus de la graisse, la coupe d'une extrémité de l'utérus à l'ovaire d'autres
7. Soulever l'utérus avec votre pince et le placer dans une boîte de Pétri avec une solution saline

3. Suppression des embryons dans l'utérus

1. Rincer avec une solution saline dans l'utérus pour enlever tout excès de sang et enlevez tout excès de graisse de l'extérieur
2. Transférer dans un plat propre avec la température ambiante. Tyrodes saline pour améliorer la visualisation
3. L'utilisation d'un stéréomicroscope, séparer chaque embryon en utilisant soit des petits ciseaux ou si fines nécessaires (# 5) pince pour détachez soigneusement l'utérus en dehors.
<li> Insérer une pince fine dans l'espace entre la paroi utérine et la caduque et peler la paroi utérine, en faisant attention à ne pas percer l'embryon

4. Suppression des caduque à partir d'embryons

1. Orienter la caduque pour que le plus sombre partie (le placenta) est face à vous
2. Faire une incision avec votre pince le long de la ligne séparant la partie sombre de la caduque de l'allume-partie, en faisant attention de ne pas couper trop profondément
3. Remplissez la séparation du placenta par le haut du sac vitellin, en faisant attention à ne pas déchirer l'ectoplacentaire cône (EPC). A ce stade, vous devriez être capable de visualiser la membrane Reicherts sur le sac vitellin
4. Continuer à supprimer l'ensemble de la decidua (légers partie) en faisant attention à ne pas percer le sac vitellin
5. Pincer doucement et retirer le Reicherts en l'arrachement de la CBE. Si le CPE est endommagé ou séparé du sac vitellin, les embryons ne parviendra pas à tourner normalement à partir E8.5 E9.5-

5. Mise en place du système de culture

1. Coupez l'extrémité d'une pipette de transfert en plastique avec des ciseaux pour augmenter le diamètre de l'ouverture de telle sorte que l'embryon peut être pipeté sans endommager le sac vitellin
2. Remplir les bouteilles à rouleaux propre avec 1 ml de milieu par embryon. Selon le type de bouteilles à rouleaux utilisés au maximum de 3-6 embryons peuvent être chargés dans chaque bouteille.
3. Transfert des embryons en utilisant votre pipette coupé à la bouteille à rouleaux supports rempli, transportant plus que Tyrodes peu que possible afin de ne pas diluer les médias
4. Fixez le bouchon en caoutchouc (bonde) au sommet de la bouteille en verre à rouleaux
5. Insérez le rouleau de bouteilles dans le tambour de la culture afin que les rouleaux un joint étanche est formé entre le bouchon et le tambour
6. Une fois que toutes les bouteilles ont été attachés, et tout emplacements vides dans le tambour ont été scellés avecbouchons en caoutchouc vec, activer le rouleau
7. Ouvrez le CO ₂ et O ₂ réservoirs et les ajuster à environ 2 psi, de sorte que la vanne de sortie publie une bulle par seconde. Pour E8.5-E10 embryons, 20% d'O ₂ et 5% de CO ₂ devraient être utilisées.
8. Assurez-vous que l'incubateur est fixé à 37 ° C et couvrir ou fermer l'incubateur afin que les embryons sont à l'abri de la lumière.
9. Les embryons doivent être vérifiés périodiquement pour évaluer leur développement par l'ajout de somities, la progression du tournage, et le degré de fermeture du tube neural
10. Après 2-3 heures de culture, les inhibiteurs pharmacologiques ou d'autres traitements peuvent être ajoutées aux médias
11. L'étude doit inclure des contrôles, tels que des véhicules ou des analogues inactifs de réactif étude.

6. Évaluer le développement après la culture de l'embryon entier

1. Coupez le gaz, arrêt au rouleau, et enlever les bouteilles de l'incubateur
2. Embryons Transfert retour à Tyrodes ou de PBS dans une boîte de Petri pour l'évaluation sous stéréomicroscope
3. Le sac vitellin devrait apparaître comme le ballon-, un battement de cœur doit être visible et la fréquence cardiaque doit être> 120 battements par minute, et la circulation devrait être évident
4. Photographie embryons avant l'enlèvement du sac vitellin, si nécessaire
5. Retirer le sac vitellin de l'embryon en perçant un trou près de la CBE, et retournant le sac vitellin et l'amnios sur la tête et la croupe de l'embryon.
6. Le cordon ombilical peut être coupé pour séparer le sac vitellin de l'embryon, et le sac vitellin peuvent être utilisés pour le génotypage de l'embryon, si nécessaire.
7. Examiner l'embryon pour le nombre des somites et des défauts du tube neural, telles que l'ouverture des plis crânienne, fermeture incomplète de la face et / ou une neuropore ouverte caudale. Les embryons peuvent être organisées selon la classification de Theiler des changements morphogénétiques multiples ( http://www.emouseatlas.org/ EMAP / home.html ) Encore une fois, un dossier photographique desdéveloppement de l'embryon est utile.

7. Remarques

1. Une dissection de haute qualité est essentielle, car n'importe quel pseudo ou déchirures dans le sac vitellin empêchera tourner avec succès et inhibent le développement normal. L'EPC peuvent également être endommagés pendant l'enlèvement de la membrane du Reichert (RM), et si le CPE est encore partiellement séparé de la vésicule ombilicale, les embryons ne se développera pas normalement. Cependant, l'élimination incomplète de la RM peut causer des embryons de rester ensemble et / ou de cellules RM peuvent proliférer dans la culture et la constriction du sac vitellin d'expansion, tant sur ce qui empêcherait un développement normal.
2. Pince propre et nette sont le secret pour obtenir une dissection bien, car une pince émoussée ou pliés rendre la procédure beaucoup plus difficile. Dépôts de protéines sur des instruments conduira à une lésion tissulaire.
3. Propre, bouteilles en verre stériles sont également essentielles pour prévenir les embryons de coller à la paroi latérale et être endommagé. Avant de commencer l'expérience, les bouteilles doivent être scrubbed eau et au savon, rincés dans de dH ₂ O, et au micro-ondes avec une petite quantité d'eau dans chaque bouteille jusqu'à ce que l'eau bout. Les bouteilles sont ensuite rincés avec 70% EtOH et sécher à l'air.
4. Le travail le plus rapidement possible, parce que le plus tôt l'embryon peut être transféré à la culture et des médias réchauffé à 37 ° C, le meilleur taux de survie.
5. Remplissez disséquer la litière en entier avant de transférer des embryons à des flacons roulants de sorte que chaque embryon est à température ambiante pour la même quantité de temps pour éviter de créer toute anomalie dans la croissance des embryons
6. Maintenir un environnement stérile pour éviter la contamination bactérienne des cultures. Nos expériences de culture ont été effectués sans antibiotique, mais de nombreux laboratoires ajouter des antibiotiques à leurs médias pour prévenir la croissance bactérienne. Le milieu doit apparaître comme évident à la fin de l'expérience comme il l'était au début de l'expérience. Si les médias est devenu nuageux ou il ya un précipité visible, il ya probablement un concontamination qui a infecté votre culture.
7. Échanges gazeux inefficace peut aussi retarder le développement des embryons, donc soyez sûr d'avoir un régulateur fiable qui assurera la prestation continue.
8. Embryons se développent environ 50% plus lent dans la culture ex vivo, il est donc essentiel de compter somites pour s'assurer que vous avez atteint le stade de développement approprié pour l'achèvement de l'expérience.

8. Les résultats représentatifs:

L'apparition d'embryons pré-et post-roller culture est illustrée dans la Figure 1. Au moment de la dissection, les embryons doivent être dans une configuration hasard (fig. 1A, D) où la queue est derrière les plis tête. Après 36 heures de culture, les embryons doivent avoir terminé tourner de sorte qu'ils soient dans le C-courbes, position fœtale, où la queue est en face de la tête (figure 1B, C, E, F). La manipulation pharmacologique avec RhoA inhibiteur de kinases (Y-27632), un inhibiteur connu de l'extension convergentes au coursneurulation (Ybot-Gonzalez, 2007), aboutit à un raccourcissement des embryons au long de leur rostrale-caudale axe (Fig. 1E, F) et inhibe la fermeture crânienne neurones pli. Nos données montrent que des doses croissantes de Y-27632 altère progressivement la fermeture crânienne fois (figure 2A) et raccourcit l'axe du corps (fig. 2B), compatible avec le rôle de l'aval de RhoA de signalisation dans la neurulation crâniens et extension convergente.

Figure 1. Apparence des embryons et la manipulation des cultures avec l'inhibiteur pharmacologique Y-27632. (A, D) embryons disséqués à E8.5 avant toute culture de l'embryon (B, E) embryons à E10 avec le sac vitellin encore intacte, à la suite de 36hrs de la culture russes. (C, F) Le sac vitellin a été enlevée pour illustrer tourner avec succès et de fermeture du tube neural. Les embryons qui ont été traités avec l'inhibiteur de la Rho kinase Y-27632 (E, F) a échoué à subir bonne extension convergente et d'illustrerun axe du corps raccourcie.

Figure 2. Effet inhibiteur de la kinase de la RhoA sur la fermeture du tube neural et l'élongation du crâne axe. (A) Le pourcentage d'embryons qui ont réussi à fermer leurs plis crânienne (NTC% = pourcentage de fermeture du tube neural) est comparée à la dose de Y-27632 ajoutée aux milieux de culture. (B) La distance entre la vésicule otique et des membres antérieurs a été significativement réduite à des doses croissantes de Y-27632 (p <0,05).

Discussion

La capacité de séparer la mère, les facteurs intra-utérine de ceux qui sont intrinsèques à l'embryon au cours de son développement est un outil important pour étudier tous les stades de l'embryogenèse. Ici, nous avons analysé les effets d'un inhibiteur de la kinase à petites molécules RhoA sur utero neurulation ex crânienne, ce qui élimine la variable du métabolisme de la mère de la drogue. Cette manipulation pharmacologique n'a un effet profond sur la neurulation crâniens et extension convergente. La sensibilité à ce composé peut être comparée entre les différents mutants génétiques de souris. La méthode présentée ici peut également être appliquée à des études d'autres voies moléculaires dans le développement, permettant la manipulation directe de la fonction cellulaire des embryons en utilisant une variété de réactifs.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Stereomicroscope for Dissection	Leica Microsystems	M165
Precision Incubator	BTC Engineering	BTC 001
Rotating Bottle Culture Unit	BTC Engineering	BTC 003
Glass Bottles for Rotating Unit	BTC Engineering	BTC 005
Silicone Rubber Bung	BTC Engineering	BTC 007
Silicone Rubber Cork	BTC Engineering	BTC 008
Gas Bubbler Inlet	BTC Engineering	BTC 012
Gas Bubbler Inlet Trap	BTC Engineering	BTC 013
Gas Bubbler Outlet	BTC Engineering	BTC 014
Gas Cylinder	Tech Air		20% O2, 5% CO2
Gas Regulator	Tech Air
Male Rat Serum	Harlan Laboratories	4520
DMEM w/o phenol red	Invitrogen	31053
10 mL Syringe	BD Biosciences	309604
Syringe Filter	Nalge Nunc international	190-2545
Large Dissecting Scissors (Blunt tip)	VWR international	82027-594
Extra Fine Bonn Scissors	Fine Science Tools	14084-08
Dumot #5 forceps	Fine Science Tools	11252-50
Tyrode’s Saline			As described in Cockroft 1990
10 cm Disposable Petri Dish	BD Biosciences	351029