Summary
कि मातृ चयापचय नजरअंदाज neurulation दौरान माउस भ्रूण के प्रत्यक्ष औषधीय हेरफेर के लिए अनुमति विधि वर्णित है. तकनीक समय बिंदु और औषधीय एजेंट द्वारा अलग neurulation के विभिन्न पहलुओं का अध्ययन करने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है.
Abstract
जेनेटिक माउस मॉडल स्तनधारी न्यूरल ट्यूब बंद करने के अध्ययन में एक महत्वपूर्ण उपकरण है (ग्रे और रॉस, 2009, रॉस, 2010). हालांकि, माउस भ्रूण के अध्ययन utero में हमारी असमर्थता को सीधे pharmacologically ब्याज की अभिकर्मक पर मातृ चयापचय के प्रभाव से अलगाव में भ्रूण में हेरफेर के द्वारा सीमित है. आहार के माध्यम से या इंजेक्शन द्वारा एक छोटा सा अणु, पुनः संयोजक प्रोटीन, या siRNA, माँ को इन पदार्थों के वितरण का उपयोग चाहे, इन अस्थिर यौगिकों शारीरिक गढ़ है कि उन्हें भ्रूण तक पहुँचने से रोकने सकता है की एक किस्म के अधीन होगा. संस्कृतियों में पूरे भ्रूण की जांच करने के लिए विकास पर आंतरिक भ्रूण प्रभाव से मातृ अलग करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.
यहाँ, हम संवर्धन माउस रोलर इनक्यूबेटर तंत्र है कि सामान्य विच्छेदन के बाद न्यूरल ट्यूब बंद (ईद्भोकेट, 1990) के लिए अनुमति देता है अत्यधिक समृद्ध मीडिया का उपयोग भ्रूण के लिए एक विधि प्रस्तुत करते हैं. संस्कृति में एक बार कर सकते हैं, भ्रूणइन विट्रो तकनीक है कि अन्यथा संभव नहीं हो सकता है अगर भ्रूण utero में अभी भी थे में पारंपरिक चालाकी का उपयोग कर. भ्रूण भाई बहन समय विभिन्न बिंदुओं पर एकत्र किया जा सकता E9.5-10 neurulation के विभिन्न पहलुओं, E7-7.5 से होने वाली (तंत्रिका प्लेट गठन, बस neurulation की दीक्षा से पहले) का अध्ययन (कपाल गुना और दुम का neuropore के समापन पर बंद करने, कॉफ़मैन, 1992). इस प्रोटोकॉल में, हम timepoints कि कपाल neurulation के अध्ययन के लिए इष्टतम हैं पर भ्रूण विदारक के लिए हमारे विधि प्रदर्शित करता है. भ्रूण E8.5 (लगभग 10-12 somities) dissected किया जाएगा है, न्यूरल ट्यूब बंद होने की दीक्षा के बाद, लेकिन पहले भ्रूण मोड़ और कपाल तंत्रिका गुना बंद है, और E10 (26-28 somities) तक संस्कृति में बनाए रखा, कपाल जब neurulation पूरा होना चाहिए.
Protocol
1. संस्कृति मीडिया की तैयारी - सभी अभिकर्मकों तालिका 1 में सूचीबद्ध हैं
- पिघलना पर नर चूहे सीरम 37 डिग्री सेल्सियस
- 30 मिनट के लिए 55 में चूहे सीरम हीट निष्क्रिय डिग्री सेल्सियस
- 10K पर कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए अपकेंद्रित्र चूहे सीरम
- Phenol लाल मुक्त DMEM w / उच्च ग्लूकोज के साथ सतह पर तैरनेवाला और मिश्रण 50:50 निकालें
- एक .45 उम सिरिंज फिल्टर का उपयोग मीडिया जीवाणुरहित
- कम से कम मीडिया / भ्रूण के 1ml तैयार किया जाना चाहिए
2. गर्भाशय के गर्भवती बांध से अलगाव
- संस्थागत पशु की देखभाल और उपयोग समिति (IACUC) द्वारा अनुमोदित प्रक्रियाओं का उपयोग करना, गर्भवती बांध पहले anesthetized है और फिर गर्भाशय ग्रीवा के अव्यवस्था द्वारा बलिदान
- 70% EtOH साथ पेट जीवाणुरहित
- Midline चुटकी के साथ त्वचा के एक छोटे पथ में, निपल लाइन बस के ऊपर बड़े संदंश के साथ और बड़े कैंची के साथ अपने संदंश नीचे पेट खोलने. किसी भी आंतरिक संरचना को नुकसान नहीं सावधान रहोएस
- अपनी कैंची का प्रयोग करें माउस के प्रत्येक पक्ष की ओर प्रारंभिक खोलने से laterally कटौती इतना है कि पूरे पेट खुला है
- आंतों और अतिरिक्त चर्बी पैड अक्सर गर्भाशय अस्पष्ट कर सकते हैं और इन अलग स्थानांतरित किया जाना चाहिए इसलिए है कि गर्भाशय और अंडाशय के शीर्ष प्रत्येक पक्ष पर देखा जा सकता है है
- अंडाशय नीचे गर्भाशय के शीर्ष चुटकी और अपनी कैंची का इस्तेमाल वसा से अलग गर्भाशय, गर्भाशय के एक छोर से दूसरे अंडाशय को काटने
- अपने संदंश और जगह के साथ नमक के साथ एक पेट्री डिश में गर्भाशय लिफ्ट
3. भ्रूण का गर्भाशय से हटाया
- नमक के साथ गर्भाशय कुल्ला किसी भी अतिरिक्त रक्त निकालने और बाहर से किसी भी अतिरिक्त चर्बी ट्रिम
- कमरे Temp के साथ एक स्वच्छ पकवान पर स्थानांतरण. दृश्य में सुधार करने के लिए खारा Tyrodes
- एक stereomicroscope का प्रयोग, प्रत्येक ध्यान से छील के अलावा गर्भाशय या तो छोटे कैंची या आवश्यक ठीक है अगर (# 5) संदंश का उपयोग भ्रूण अलग. <> ली गर्भाशय की दीवार और पत्या के बीच अंतरिक्ष और वापस गर्भाशय की दीवार छील में ठीक संदंश सम्मिलित नहीं भ्रूण बेध करने के लिए सावधान किया जा रहा
4. आँवल के भ्रूण से हटाया
- ओरिएंट पत्या इतना है कि तुम से दूर गहरा भाग (प्लेसेंटा) का सामना करना पड़ रहा है
- हल्का भाग से पत्या के अंधेरे हिस्से को अलग लाइन के साथ अपने संदंश के साथ एक चीरा भी गहराई में कटौती नहीं करने के लिए सावधान किया जा रहा
- जर्दी थैली के ऊपर से नाल की जुदाई पूरा करें, ectoplacental शंकु (ईपीसी) आँसू नहीं सावधान किया जा रहा है. इस बिंदु पर आप जर्दी थैली पर Reicherts झिल्ली कल्पना करने में सक्षम होना चाहिए
- पूरे आँवल (हल्का भाग) नहीं पियर्स जर्दी थैली के लिए सावधान किया जा रहा हटाने के लिए जारी रखें
- धीरे चुटकी और यह ईपीसी से दूर छीलने द्वारा Reicherts हटायें. यदि ईपीसी क्षतिग्रस्त या जर्दी थैली से अलग है, भ्रूण E8.5 - E9.5 से सामान्य बारी असफल हो जायेगी
5. संस्कृति प्रणाली की स्थापना
- कैंची को खोलने के व्यास में वृद्धि के साथ एक प्लास्टिक हस्तांतरण विंदुक के अंत कट इतना है कि एक भ्रूण की जर्दी थैली को नुकसान पहुँचाए बिना pipetted किया जा सकता है
- भ्रूण के प्रति मीडिया के 1 मिलीलीटर के साथ स्वच्छ रोलर बोतलें भरें. रोलर बोतलों के प्रकार के आधार पर इस्तेमाल अधिकतम 3-6 भ्रूण की प्रत्येक बोतल में लोड किया जा सकता है.
- मीडिया से भरे रोलर बोतल को अपने कटौती पिपेट का उपयोग, संभव के रूप में थोड़ा Tyrodes के रूप में ले जाने भ्रूण इतनी के रूप में कमजोर नहीं मीडिया स्थानांतरण
- कांच रोलर की बोतल के शीर्ष करने के लिए रबर प्लग (डाट) संलग्न
- रोलर संस्कृति ड्रम में रोलर बोतलें तो सम्मिलित करें कि एक तंग सील प्लग और ड्रम के बीच बनाई है
- एक बार सभी बोतलों संलग्न किया गया है, और ड्रम में किसी भी खाली स्लॉट w सील कर दिया गया हैith रबड़ stoppers, रोलर सक्रिय
- सीओ 2 और ओ 2 टैंक खोलें और उन्हें लगभग 2 साई को समायोजित, ताकि आउटलेट वाल्व प्रति सेकंड एक बुलबुला जारी है. E8.5-E10 भ्रूण के लिए, 20% 2 हे और 5% सीओ 2 इस्तेमाल किया जाना चाहिए.
- सुनिश्चित करें कि इनक्यूबेटर 37 के लिए सेट किया जाता है डिग्री सेल्सियस और कवर या इनक्यूबेटर बंद इतना है कि भ्रूण प्रकाश से परिरक्षित हैं.
- भ्रूण समय - समय पर जाँच की जानी चाहिए somities, मोड़ की प्रगति के अलावा, और न्यूरल ट्यूब बंद होने की हद तक उनके विकास का आकलन
- संस्कृति में 2-3 घंटे के बाद, औषधीय inhibitors या अन्य उपचार मीडिया को जोड़ा जा सकता है है
- अध्ययन डिजाइन नियंत्रण, जैसे वाहन या अध्ययन अभिकर्मक के निष्क्रिय analogues शामिल होना चाहिए.
6. पूरे भ्रूण संस्कृति के बाद विकास का मूल्यांकन
- गैस बंद मुड़ें रोलर बंद करो, और इनक्यूबेटर से बोतलों हटायें
- स्थानांतरण भ्रूण को वापस Tyrode करने के लिएया stereomicroscope के तहत मूल्यांकन के लिए एक पेट्री डिश में पीबीएस
- जर्दी थैली गुब्बारे की तरह दिखाई देते हैं, एक दिल की धड़कन दिखाई और हृदय की दर होना चाहिए> मिनट प्रति 120 धड़कता है, और रक्त परिसंचरण चाहिए किया जाना चाहिए स्पष्ट हो
- तस्वीर की जर्दी थैली हटाने के लिए पहले भ्रूण के रूप में यदि आवश्यक हो तो
- ईपीसी के पास एक छेद काटने और सिर और भ्रूण की दुम पर जर्दी थैली और भ्रूणावरण flipping के द्वारा की जर्दी थैली भ्रूण से निकालें.
- गर्भनाल जर्दी थैली भ्रूण से अलग काट किया जा सकता है, और जर्दी थैली यदि आवश्यक हो तो भ्रूण जीनोटाइपिंग के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.
- विखंड संख्या और खुला कपाल सिलवटों, चेहरे और / या एक खुले दुम का neuropore की अधूरी बंद जैसे न्यूरल ट्यूब दोष के लिए भ्रूण जांच करते हैं. भ्रूण के अनुसार कई morphogenetic परिवर्तन के Theiler वर्गीकरण (मंचन किया जा सकता है http://www.emouseatlas.org/ emap / home.html ) फिर से, एक फ़ोटो रिकॉर्डभ्रूण विकास उपयोगी है.
7. नोट्स
- एक उच्च गुणवत्ता विच्छेदन आवश्यक है, क्योंकि किसी भी निक या जर्दी थैली में आँसू सफल मोड़ रोकने के लिए और सामान्य विकास को बाधित करेगा. ईपीसी रीचर्ट झिल्ली (RM) को हटाने के दौरान भी क्षतिग्रस्त किया जा सकता है, और अगर ईपीसी भी आंशिक रूप से जर्दी थैली से अलग है, भ्रूण सामान्य रूप से विकास नहीं होगा. हालांकि, आर एम की अधूरी हटाने भ्रूण के साथ छड़ी करने के लिए और / या RM कोशिकाओं संस्कृति में अधिक बढ़ना और जर्दी थैली विस्तार है, जो दोनों के सामान्य विकास को रोका जा सके कसना सकता है हो सकता है.
- स्वच्छ और तेज संदंश रहस्य के लिए एक अच्छा विच्छेदन हो रही हैं, क्योंकि सुस्त या तुला संदंश प्रक्रिया काफी अधिक मुश्किल बना. यंत्र पर प्रोटीन जमा ऊतकों को नुकसान के लिए नेतृत्व करेंगे.
- स्वच्छ, बाँझ कांच की बोतलें भी कर रहे हैं ओर दीवार के लिए चिपके हुए और क्षतिग्रस्त होने से भ्रूण को रोकने के लिए आवश्यक है. पहले प्रयोग शुरू करने के लिए, बोतलों scr होना चाहिएसाबुन और पानी के साथ ubbed, DH 2 हे में rinsed है, और जब तक पानी फोड़े प्रत्येक बोतल में पानी की छोटी राशि के साथ microwaved. बोतलें तो 70% EtOH के साथ rinsed हैं और शुष्क हवा की अनुमति दी.
- जितना जल्दी संभव हो काम है, क्योंकि जल्दी भ्रूण संस्कृति मीडिया के लिए हस्तांतरित किया जा सकता है और 37 के लिए वापस डिग्री सेल्सियस बेहतर अस्तित्व गरम.
- रोलर की बोतलों के लिए किसी भी भ्रूण को स्थानांतरित करने से पहले पूरे कूड़े विदारक ताकि प्रत्येक भ्रूण भ्रूण के विकास में कोई फ़र्क बनाने से बचने के समय का एक ही राशि के लिए कमरे के तापमान पर है पूरा करें
- संस्कृतियों के जीवाणु संक्रमण को रोकने के एक बाँझ वातावरण बनाए रखें. हमारी संस्कृति प्रयोगों एंटीबायोटिक के बिना किया गया है, लेकिन कई प्रयोगशालाओं अपने मीडिया के लिए एंटीबायोटिक जोड़ने के लिए जीवाणु वृद्धि को रोकने. माध्यम के रूप में स्पष्ट प्रयोग के अंत में प्रदर्शित होने के रूप में यह प्रयोग की शुरुआत में हुई थी. चाहिए. यदि मीडिया बादल बन गया है या वहाँ एक दृश्य वेग है, वहाँ की संभावना एक चोर हैtamination है कि अपनी संस्कृति संक्रमित है.
- अप्रभावी गैस आदान - प्रदान भी भ्रूण के विकास में देरी कर सकते हैं ताकि एक विश्वसनीय नियामक है कि निरंतर वितरण सुनिश्चित करेंगे यकीन है.
- भ्रूण पूर्व vivo संस्कृति में लगभग 50% धीमी विकास, इसलिए यह जरूरी है somites गिनती करने के लिए सुनिश्चित करें कि आप प्रयोग के पूरा करने के लिए विकास के उचित मंच तक पहुँच चुके हैं.
8. प्रतिनिधि परिणाम:
भ्रूण की उपस्थिति पूर्व और बाद रोलर संस्कृति चित्रा 1 में सचित्र है. विच्छेदन के समय में, भ्रूण एक बेसुरा (छवि 1 ए, डी) विन्यास जहां पूंछ सिर सिलवटों के पीछे में होना चाहिए. संस्कृति में 36 बजे के बाद, भ्रूण इतनी पूरा बदल करना चाहिए कि वे सी घुमावदार, भ्रूण की स्थिति है, जहां पूंछ सिर (चित्र 1 बी, सी, ई, एफ) के सामने है में हैं. RhoA kinase अवरोध करनेवाला (वाई 27,632), एक ज्ञात संसृत विस्तार के दौरान अवरोध करनेवाला के साथ भेषज हेरफेरneurulation (Ybot गोंजालेज, 2007), अपने विजय - स्तम्भ - दुम का अक्ष (छवि 1E, एफ) के साथ भ्रूण और कपाल तंत्रिका गुना बंद रोकता है की एक छोटा करने में परिणाम. हमारे डेटा बताते हैं कि वाई +२७,६३२ की बढ़ती खुराक उत्तरोत्तर कपाल गुना बंद impairs (2A चित्रा) और शरीर (छवि 2B) अक्ष, डाउनस्ट्रीम RhoA कपाल neurulation और संसृत विस्तार में संकेत की भूमिका के साथ संगत shortens.
चित्रा 1 संस्कृतियों और भ्रूण औषधीय अवरोध करनेवाला वाई 27,632 के साथ हेरफेर के रूप E8.5 (ए डी,) dissected पूरे भ्रूण संस्कृति से पहले भ्रूण (बी, ई) की जर्दी थैली अभी भी बरकरार है, रोलर संस्कृति के 36hrs बाद के साथ E10 में भ्रूण. (सी, एफ) की जर्दी थैली सफल मोड़ और न्यूरल ट्यूब बंद वर्णन करने के लिए हटा दिया गया है. भ्रूण कि रो kinase अवरोध करनेवाला वाई - २७,६३२ (ई, एफ) के साथ इलाज किया गया उचित संसृत विस्तार से गुजरना और उदाहरण देकर स्पष्ट करने में विफल रहा हैएक छोटा शरीर अक्ष.
चित्रा 2 RhoA kinase अवरोध करनेवाला के कपाल न्यूरल ट्यूब बंद करने और अक्ष बढ़ाव पर प्रभाव . (ए) भ्रूण का प्रतिशत है कि सफलतापूर्वक अपने कपाल सिलवटों बंद (% एनटीसी = प्रतिशत न्यूरल ट्यूब बंद) करने में सक्षम थे वाई 27,632 की खुराक की तुलना में है संस्कृति मीडिया के लिए जोड़ा. (बी) वाई २७६३२ की बढ़ती खुराक (पी <0.05) पर कान पुटिका और forelimb के बीच की दूरी काफी कम हो गया था.
Discussion
जो कि अपने विकास के दौरान भ्रूण के आंतरिक से मातृ, अंतर्गर्भाशयी कारकों को अलग करने की क्षमता embryogenesis के सभी चरणों के अध्ययन के लिए एक महत्वपूर्ण उपकरण है. यहाँ हम RhoA kinase के कपाल neurulation पूर्व utero पर एक छोटा सा अणु अवरोध करनेवाला है, जिससे दवा की मातृ चयापचय के चर को हटाने के प्रभाव का विश्लेषण किया है. यह औषधीय हेरफेर कपाल neurulation और संसृत विस्तार पर एक गहरा प्रभाव पड़ता है. इस परिसर के लिए संवेदनशीलता अलग आनुवंशिक माउस म्यूटेंट के बीच तुलना की जा सकती है. यहाँ प्रस्तुत पद्धति का भी विकास में अन्य आणविक मार्ग के अध्ययन के लिए लागू किया जा सकता सकता, अभिकर्मकों की एक किस्म का उपयोग भ्रूण में सेलुलर समारोह के सीधे हेरफेर की अनुमति है.
Disclosures
ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.
Acknowledgments
हम विच्छेदन और संस्कृति तकनीक के साथ उपयोगी सलाह के लिए ए Hadjantonakis (स्लोअन-Kettering संस्थान) की प्रयोगशाला और एल Niswander (कोलोराडो डेनवर यू) की प्रयोगशाला को धन्यवाद देना चाहूंगा. इस काम JDG और RO1NS05897 एल Niswander और जे Nadeau (सिस्टम्स बायोलॉजी के लिए संस्थान) के साथ सहयोग में मेर एनआरएसए NS059562 द्वारा समर्थित किया गया है.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Stereomicroscope for Dissection | Leica Microsystems | M165 | |
| Precision Incubator | BTC Engineering | BTC 001 | |
| Rotating Bottle Culture Unit | BTC Engineering | BTC 003 | |
| Glass Bottles for Rotating Unit | BTC Engineering | BTC 005 | |
| Silicone Rubber Bung | BTC Engineering | BTC 007 | |
| Silicone Rubber Cork | BTC Engineering | BTC 008 | |
| Gas Bubbler Inlet | BTC Engineering | BTC 012 | |
| Gas Bubbler Inlet Trap | BTC Engineering | BTC 013 | |
| Gas Bubbler Outlet | BTC Engineering | BTC 014 | |
| Gas Cylinder | Tech Air | 20% O2, 5% CO2 | |
| Gas Regulator | Tech Air | ||
| Male Rat Serum | Harlan Laboratories | 4520 | |
| DMEM w/o phenol red | Invitrogen | 31053 | |
| 10 mL Syringe | BD Biosciences | 309604 | |
| Syringe Filter | Nalge Nunc international | 190-2545 | |
| Large Dissecting Scissors (Blunt tip) | VWR international | 82027-594 | |
| Extra Fine Bonn Scissors | Fine Science Tools | 14084-08 | |
| Dumot #5 forceps | Fine Science Tools | 11252-50 | |
| Tyrode’s Saline | As described in Cockroft 1990 | ||
| 10 cm Disposable Petri Dish | BD Biosciences | 351029 |
References
- Cockroft, D. L. Dissection and culture of post implantation embryos. Mammalian Postimplantation Embryos A Practical Approach. Copp, A. J., Cockroft, D. L. , IRL Press. Oxford. (1990).
- Gray, J. D., Ross, M. E. Mechanistic insights into folate supplementation from Crooked tail and other NTD-prone mutant mice. Birth Defects Res. A. Clin. Mol. Teratol. 85, 314-321 (2009).
- Kaufman, M. H. The Atlas of Mouse Development. , Academic Press Limited. San Diego. (1992).
- Ybot-Gonzalez, P., Savery, D., Gerrelli, D., Signore, M., Mitchell, C. E., Faux, C. H., Greene, N. D., Copp, A. J. Convergent extension, planar-cell-polarity signalling and initiation of mouse neural tube closure. Development. 134, 789-799 (2007).
- Ross, M. E. Gene-environment interactions, folate metabolism and the embryonic nervous system. Wiley Interdiscip Rev Syst Biol Med. 2, 471-480 (2010).
