Summary
산모 신진 대사를 무시 neurulation 동안 마우스 배아의 직접적인 약리 조작에 대한 허용하는 방법을 설명합니다. 이 기술은 시점과 약리 에이전트를 변화하여 neurulation의 다양한 측면을 연구하기 위해 적용할 수 있습니다.
Abstract
유전자 마우스 모델은 포유류의 신경 튜브 폐쇄의 연구에 중요한 도구입니다 (회색 & Ross에서 2009 년, 로스, 2010). 그러나, utero에서 마우스 배아의 연구는 직접 pharmacologically 관심 시약에 산모 대사의 영향으로부터 격리 배아를 조작하기 위해 무능력에 의해 제한됩니다. 다이어트를 통해 또는 사출에 의해 작은 분자, 재조합 단백질, 또는 siRNA, 어머니 이러한 물질의 전달을 사용하든하면 그들은 배아에 도달하지 못하도록 할 수 신체적 방어의 다양한 이러한 불안 정한 화합물을 적용합니다. 전체 배아의 문화의 조사는 개발에 본질적인 영향 태아에서 산모 분리하는 데 사용할 수 있습니다.
여기, 우리는 절개 후 정상적인 신경 튜브 폐쇄 (크로켓, 1990)을 허용 롤러 인큐베이터 기기에서 높은 농축 미디어를 사용 culturing 마우스 배아에 대한 방법을 제시한다. 일단 문화, 배아 수배아는 utero 아직이라면 그렇지 않으면 불가능했을 체외 기법에서 기존 사용하고 조작합니다. 배아 형제 자매는 (두개골 접어 꼬리 neuropore의 결론에 E9.5 - 10 E7 - 7.5에서 발생 neurulation의 다양한 측면을, (neurulation의 개시에 직전 신경 판 형성) 연구에 여러 시간 지점에서 수령 가능 클로저, 카우프만은, 1992). 이 프로토콜에서는, 우리는 두개골 neurulation의 학습을위한 최적의 아르 timepoints에서 배아를 해부위한 방법을 보여줍니다. 배아는 신경 튜브 폐쇄의 개시 이후지만, 이전에 배아 돌려 두개골 신경 접어 클로저로, E8.5 (약 10-12 somities)에서 해부하고, E10 (26-28 somities)까지 문화에 유지됩니다 때 두개골 neurulation가 완료되어야합니다.
Protocol
1. 문화 미디어의 준비 - 모든 시약은 표 1에 나열되어
- 37 해동 남자 쥐 혈청 ° C.
- 55시 30 분에 대한 쥐 혈청을 열 Inactivate ° C
- 상온에서 5 분 10K에 대한 원심의 쥐 혈청
- 페놀 - 붉은 무료 DMEM w / 높은 혈당과 함께 뜨는와 혼합 50:50를 제거
- 0.45 음 주사기 필터를 사용하여 미디어를 소독
- 미디어 / 배아의 최소한 1ml 준비되어야한다
2. 임신 댐에서 자궁의 분리
- 기관 동물 케어 및 사용위원회 (IACUC)에 의해 승인 절차를 사용하여 임신 댐 먼저 anesthetized하고 다음 경추 탈구하여 희생
- 70% EtOH로 복부를 소독
- 큰 집게로 그냥 유두 선 위에 중간선에 따라 피부의 작은 경로를 꼬집어 대형 가위와 집게 아래 복부를 엽니다. 어떤 내부 구조를 손상하지 않도록주의의
- 전체 복부가 열려 있도록 마우스의 양쪽 방향으로 초기 오프닝에서 옆으로 절단에 가위를 사용하여
- 창자와 여분의 지방 패드는 종종 자궁을 가리 수 있으며, 이들은 자궁과 난소의 맨 위에는 양쪽에 관찰 할 수 있도록 별도로 이동합니다
- 난소 아래 자궁의 상단을 핀치과 다른 난소에 자궁의 한쪽에서 절단, 지방에서 자궁을 분리하여 가위를 사용하여
- 식염수에 페트리 접시에 포셉, 장소와 자궁을 허용
3. 자궁에서 태아의 제거
- 초과 혈액을 제거하고 외부에서 초과 지방을 장식하기 위해 식염수로 자궁을 씻어
- 방 온도와 깨끗한 접시에 전송합니다. 시각화을 향상시키기 위해 염분 Tyrodes
- stereomicroscope 사용하여 조심스럽게 떨어져 자궁 껍질에 작은 가위 또는 필요할 경우 벌금 (# 5) 포셉 중 하나를 사용하여 각 배아를 구분합니다. <리>하지 피어스 배아에주의하고, 이번에는 질 벽에과 decidua 사이에는 질 벽에 다시 껍질 공간에 멋진 집게를 넣습니다
4. 배아에서 decidua 제거
- 동양 decidua 너무 어두운 부분 (태반)은 당신을 멀리 마주보고입니다
- 너무 깊이 잘라 않도록 조심하고, 밝은 부분에서 decidua의 어두운 부분을 분리 라인 함께 집게와 절개를합니다
- ectoplacental 원추형 (EPC)를 찢어 않도록 조심하고, 난황 상단에서 태반의 분리를 완료합니다. 이 시점에서 당신은 난황에 Reicherts 막을 시각화 할 수 있어야한다
- 하지 피어스 난황에주의되는 전체 decidua를 (밝은 부분)를 제거하기 위해 계속
- 부드럽게 꼬집어 및 EPC에서 물러나고하여 Reicherts를 제거합니다. EPC가 손상 또는 난황에서 분리되면, 태아는 E8.5 - E9.5에서 정상적으로 설정되지 않을
5. 문화 시스템을 설정
- 태아가 난황을 손상시키지 않고 pipetted 수 있도록 개방의 직경을 증가 가위로 플라스틱 전송 피펫의 끝을 잘라
- 배아 당 미디어 1 ML과 깨끗한 롤러 병을 채우십시오. 3-6 배아의 최대 사용하는 롤러 병의 종류에 따라하는 것은 각 병에 로드할 수 있습니다.
- 가능한 작은 Tyrodes 등으로 운반, 미디어 가득한 롤러 병에 커팅 피펫을 사용하여 배아가있는만큼 미디어를 희석하지 송금
- 유리 롤러 병의 상단에 고무 플러그 (마개)을 첨부
- 시일이 플러그와 드럼 사이에 형성되도록 롤러 문화 드럼에 롤러 병을 삽입
- 일단 모든 병이 첨부되어 있고, 드럼에 빈 슬롯이 w를 봉인되었습니다ith 고무 stoppers은 롤러를 활성화
- CO 2와 O 2 탱크를 열고 콘센트 밸브는 초 당 한 방울을 공개 있도록 약 2 PSI 그들을 조정할 수 있습니다. E8.5 - E10 배아의, 20 % O 2와 5퍼센트 CO 2를 사용해야합니다.
- 인큐베이터가 37로 설정되어 있는지 확인 ° C와 표지 또는 배아가 빛으로부터 격리되도록 배양기를 닫습니다.
- 태아도 somities의 추가, 회전의 진행, 그리고 신경 튜브 폐쇄의 범위에서 자신의 발전을 평가하기 위해 정기적으로 확인하여야한다
- 문화 2-3시간 후, 약리 억제제 또는 다른 치료가 언론에 추가할 수 있습니다
- 연구 설계는 자동차 또는 연구 시약의 비활성 analogues 같은 컨트롤을 포함해야합니다.
6. 전체 배아 문화 이후 개발 평가
- 가스를 끄고, 롤러를 중지하고, 배양기에서 병을 제거
- 전송 배아 다시 Tyrode로stereomicroscope에 따라 평가를위한 배양 접시에있는 s 또는 PBS
- 난황은> 120 분 당 비트, 그리고 혈액 순환을 명백히해야한다 심장 박동을 볼 수도과 심장 박동을해야, 풍선처럼 나타납니다
- 이전에 난황 제거하기 위해 사진의 배아 필요한 경우
- EPC 근처에 구멍을 절단하고 배아의 머리와 엉덩이에 걸쳐 난황과 양막을 틀지하여 배아의 난황을 제거합니다.
- 탯줄은 태아의 난황을 분리자를 수 있으며, 난황이 필요한 경우 배아를 genotyping 사용할 수 있습니다.
- 이러한 오픈 두개골 주름, 얼굴 및 / 또는 오픈 꼬리 neuropore의 불완전한 폐쇄로 체절 번호와 신경 튜브 결함에 대한 배아를 검사합니다. 배아는 여러 morphogenetic 변경 Theiler 분류 (에 따라 공연 수 있습니다 emap / home.html을 http://www.emouseatlas.org/ 다시)의 사진 기록배아 개발에 유용합니다.
7. 노트
- 어떤 별명이나 난황에 눈물이 성공적으로 선회를 방지하고 정상적인 발달을 억제하기 때문에 고품질의 절개가 필수적입니다. EPC는 또한 Reichert의 멤브레인 (RM)의 제거 중에 손상될 수 있으며 EPC가도 부분적으로 난황에서 분리된 경우 배아가 정상적으로 발전하지 않습니다. 그러나, RM의 불완전한 제거는 배아가 또는 RM 세포 문화에 자라다와 정상적인 발전을 방지 둘 다있는 난황 확장, 혈관 수 있습니다 뭉쳐 및 /가 발생할 수 있습니다.
- 썩은 또는 구부러진 집게는 프로 시저가 훨씬 더 어려워하기 때문에 깨끗하고 날카로운 집게가 좋은 절개를 받고하는 비밀입니다. 악기에 단백질 예금은 조직 손상으로 이어질 것입니다.
- 깨끗하고 무균 유리병 또한 측면 벽에 고집하고 손상되는 배아를 방지하기 위해 필수적입니다. 전에 실험을 시작하기 위해, 병 SCR해야, 비누와 물로 ubbed DH 2 O에 씻어서, 그리고 물 종기까지 각 병에 물을 작은 양의 microwaved. 병 그 다음 70% EtOH로 씻어서 건조 공기 사용할 수 있습니다.
- 빨리 배아 문화 미디어로 전송 수 있으며 ° C 더 나은 생존을 37로 다시 따뜻하게하기 때문에, 가능한 빨리 작동합니다.
- 각각의 배아가 배아의 성장에 차이를 만드는 피하기 위해 시간의 동일한 금액에 실온에서되도록 롤러 병 어떤 배아를 전송하기 전에 전체 쓰레기를 해부 완료
- 문화의 세균 오염을 방지하기 위해 멸균 환경을 유지합니다. 우리 문화 실험은 항생제없이 수행하지만, 많은 실험실은 박테리아의 성장을 방지하기 위해 미디어에 항생 추가되었습니다. 이 실험의 시작 부분에 있었어요으로 매체 실험의 끝에처럼 맑은 나타납니다. 미디어 흐린되었다 또는 가시 침전물이있다면 절약 가능성이 높습있다당신의 문화를 감염 tamination.
- 비효과 가스 교환도 배아 개발 지연 때문에 지속적인 전달을 보장하는 안정적인 조절을 확인하실 수 있습니다.
- 배아는 전직 생체내 문화에 약 50 % 느린 개발, 그러므로 당신이 실험의 완료 개발의 적절한 단계에 도달했는지 확인하기 위해 somites를 계산하는 것이 필수적입니다.
8. 대표 결과 :
배아의 모양 사전 및 사후 롤러 문화 그림 1에서 보여주고있다. 해부 당시 태아는 꼬리가 머리 폴드 뒤에 선반 가공을하지 않은 구성 (그림 1A, D)에 있어야합니다. 문화의 36 시간 후, 배아들은 꼬리가 머리 (그림의 1B, C, E, F)의 앞에있는 C - 곡선, 태아형 자세에서되도록 전환 완료해야합니다. RhoA 키나제 저해제 (Y - 27632), 동안 집중 확장 알려진 억제제 약리 조작neurulation (Ybot - 곤잘레스, 2007), 그들의 주동이의 - 꼬리 축 (그림 1E, F)을 따라 배아 및 두개골 신경 배 폐쇄를 억제의 단축을 초래합니다. 우리의 데이터는 Y - 27632의 양이 점차 증가 두개골 배 폐쇄 impairs (그림 2A) 및 다운 스트림 RhoA는 두개골 neurulation과 집중 확장 신호의 역할과 일치 바디 축 (그림 2B)를 단축 것을 보여줍니다.
그림 1. 약리 억제제 Y - 27632와 함께 문화 배아 및 조작의 외관. 이전에 전체 배아 문화 E8.5에서 (A, D)를 해부 배아 (B, E) 난황 롤러 문화의 36hrs에, 아직도 건재 이후로 E10에 태아. (C, F) 난황은 성공적인 전환과 신경 튜브 폐쇄를 설명하기 삭제되었습니다. Rho 키나제 억제제 Y - 27632 (E, F)로 처리되었습니다 배아는 제대로 수렴 확장자를 받아야하고 설명하는 데 실패짧은 바디 축.
그림 2. 두개골 신경 튜브 폐쇄 및 축 신장에서 RhoA의 키나제 억제제의 효과. (A) (% NTC = 비율 신경 튜브 폐쇄)은 두개골 주름을 성공적으로 닫을 수 있었다 배아의 비율은 Y - 27632의 복용량 비교 문화 미디어에 추가됩니다. (B) 귀의 소포와 forelimb 사이의 거리는 상당히 Y - 27632의 증가 복용 (P는 <0.05)에서 감소했다.
Discussion
개발하는 동안 배아에 내장하는 사람에서 산모, 자궁 내 요인을 구분하는 능력은 embryogenesis의 모든 단계를 공부를위한 중요한 도구입니다. 여기함으로써 약물의 산모 대사의 변수를 제거 두개골 neurulation의 전 제품 utero에서 RhoA의 키나제의 작은 분자 억제제의 효과를 분석했습니다. 이 약리 조작 두개골 neurulation과 집중 확장에 지대한 영향을했습니다. 이 화합물에 감도는 서로 다른 유전자 돌연변이 마우스 가운데 비교할 수 있습니다. 여기서 제시하는 방법은 시약의 다양한 사용하여 배아에서 세포 기능의 직접 조작하므로 개발에있는 다른 분자 경로의 연구에도 적용될 수 있습니다.
Disclosures
관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.
Acknowledgments
우리는 해부와 문화 기술과 유용한 조언 A. Hadjantonakis (슬로안 - Kettering 연구소)의 실험실과 L. Niswander (콜로라도 - 덴버 U)의 실험실을 감사드립니다. 이 작품은 L. Niswander와 J. Nadeau (시스템 생물학 연구소)와 공동으로 메르 JDG 및 RO1NS05897에 NRSA NS059562에 의해 지원되었습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Stereomicroscope for Dissection | Leica Microsystems | M165 | |
| Precision Incubator | BTC Engineering | BTC 001 | |
| Rotating Bottle Culture Unit | BTC Engineering | BTC 003 | |
| Glass Bottles for Rotating Unit | BTC Engineering | BTC 005 | |
| Silicone Rubber Bung | BTC Engineering | BTC 007 | |
| Silicone Rubber Cork | BTC Engineering | BTC 008 | |
| Gas Bubbler Inlet | BTC Engineering | BTC 012 | |
| Gas Bubbler Inlet Trap | BTC Engineering | BTC 013 | |
| Gas Bubbler Outlet | BTC Engineering | BTC 014 | |
| Gas Cylinder | Tech Air | 20% O2, 5% CO2 | |
| Gas Regulator | Tech Air | ||
| Male Rat Serum | Harlan Laboratories | 4520 | |
| DMEM w/o phenol red | Invitrogen | 31053 | |
| 10 mL Syringe | BD Biosciences | 309604 | |
| Syringe Filter | Nalge Nunc international | 190-2545 | |
| Large Dissecting Scissors (Blunt tip) | VWR international | 82027-594 | |
| Extra Fine Bonn Scissors | Fine Science Tools | 14084-08 | |
| Dumot #5 forceps | Fine Science Tools | 11252-50 | |
| Tyrode’s Saline | As described in Cockroft 1990 | ||
| 10 cm Disposable Petri Dish | BD Biosciences | 351029 |
References
- Cockroft, D. L. Dissection and culture of post implantation embryos. Mammalian Postimplantation Embryos A Practical Approach. Copp, A. J., Cockroft, D. L. , IRL Press. Oxford. (1990).
- Gray, J. D., Ross, M. E. Mechanistic insights into folate supplementation from Crooked tail and other NTD-prone mutant mice. Birth Defects Res. A. Clin. Mol. Teratol. 85, 314-321 (2009).
- Kaufman, M. H. The Atlas of Mouse Development. , Academic Press Limited. San Diego. (1992).
- Ybot-Gonzalez, P., Savery, D., Gerrelli, D., Signore, M., Mitchell, C. E., Faux, C. H., Greene, N. D., Copp, A. J. Convergent extension, planar-cell-polarity signalling and initiation of mouse neural tube closure. Development. 134, 789-799 (2007).
- Ross, M. E. Gene-environment interactions, folate metabolism and the embryonic nervous system. Wiley Interdiscip Rev Syst Biol Med. 2, 471-480 (2010).
