Neural Tube stengning i Mouse Whole Embryo Kultur

Summary

En metode som åpner for direkte farmakologisk manipulasjon av mus embryo under neurulation som forbigår mors metabolisme er beskrevet. Teknikken kan tilpasses til å studere ulike aspekter ved neurulation ved å variere tidspunktet og farmakologiske agent.

Abstract

Genetiske musemodeller er et viktig verktøy i studiet av pattedyr nevralrørsdefekter stenging (Gray & Ross, 2009; Ross, 2010). Imidlertid er studiet av musen embryo i utero begrenset av vår manglende evne til direkte farmakologisk manipulere embryoene isolert fra virkningene av mors metabolisme på reagensen av interesse. Enten ved hjelp av et lite molekyl, rekombinant protein, eller siRNA, levering av disse stoffene til moren, gjennom kosten eller ved injeksjon vil underlagt disse ustabile forbindelser til en rekke kroppslig forsvar som kunne hindre dem fra å nå embryo. Undersøkelser i kulturer av hele embryo kan brukes til å skille maternal fra indre foster effekter på utvikling.

Her presenterer vi en metode for dyrking mus embryo bruke høyanriket medier i en berg-inkubator apparat som gjør det mulig for normal neural tube avslutning etter disseksjon (Crockett, 1990). En gang i kultur, embryoer kanbli manipulert ved hjelp av konvensjonelle in vitro teknikker som ellers ikke ville være mulig hvis embryoene var fortsatt i utero. Embryo søsken kan hentes på ulike tidspunkter å studere ulike aspekter av neurulation, som oppstår fra E7-7.5 (nevral plate formasjon, like før oppstart av neurulation) til E9.5-10 (ved avslutningen av kraniale fold og kaudale neuropore nedleggelse, Kaufman, 1992). I denne protokollen, viser vi vår metode for dissecting embryoer på tidspunkter som er optimale for studiet av kraniale neurulation. Befruktede egg vil bli dissekert på E8.5 (ca. 10-12 somities), etter initiering av neural tube nedleggelse, men før embryo snu og kraniale nevrale fold nedleggelse og vedlikeholdes i kultur till E10 (26-28 somities), når kranial neurulation bør være komplett.

Protocol

1. Utarbeidelse av kultur medier - alle reagenser er listet opp i tabell 1

1. Tin hann rotte serum ved 37 ° C.
2. Heat-inaktivere rotte serum for 30 minutter ved 55 ° C
3. Sentrifuger rotte serum ved 10K for 5 minutter ved romtemperatur
4. Fjern supernatanten og bland 50:50 med fenol-rød free DMEM m / høy Glukose
5. Steriliser media ved hjelp av en 0,45 um sprøyte filter
6. Minst 1 ml media / embryo bør utarbeides

2. Isolasjon av livmoren fra gravide dam

1. Ved hjelp av prosedyrer godkjent av Institutional Animal Care og bruk Committee (IACUC), er gravid demningen første bedøvet og så ofret av cervikal forvridning
2. Sterilisere magen med 70% EtOH
3. Knip en liten sti av huden langs midtlinjen, like over brystvorten linje, med store tang og åpne buken under dine tang med stor saks. Vær forsiktig så du ikke skader noen interne strukturener
4. Bruk saks til å klippe lateralt fra den opprinnelige åpningen mot hver side av musen slik at hele magen er åpen
5. Tarmen og overflødig fett pads kan ofte skjule livmor og disse bør flyttes til side slik at toppen av livmor og eggstokker kan observeres på hver side
6. Klem toppen av livmoren under eggstokkene og bruke saks for å skille livmor fra fett, kutte fra den ene enden av livmoren til den andre eggstokken
7. Løft ut livmoren med tang og plasser i en petriskål med saltvannsoppløsning

3. Fjerning av embryo fra livmor

1. Skyll livmoren med saltvann for å fjerne overflødig blod og trim overflødig fett fra utsiden
2. Overføring til en ren tallerken med rom temp. Tyrodes saltvann for å bedre visualisering
3. Ved hjelp av en stereomikroskop, separat hver embryo ved hjelp av enten liten saks eller om nødvendig fine (# 5) pinsett nøye skrelle livmoren hverandre.
<li> Sett fin pinsett inn i mellomrommet mellom livmor veggen og decidua og skrelle tilbake livmorveggen, være forsiktig for ikke å pierce embryo

Fire. Fjerning av decidua fra embryo

1. Orient den decidua slik at mørkere delen (placenta) er vendt bort fra deg
2. Lag et snitt med tang langs linjen som deler den mørke delen av decidua fra den lettere delen, være forsiktig med å kutte for dypt
3. Fullfør atskillelse av placenta fra toppen av plommesekken, være forsiktig for ikke å rive ectoplacental kjeglen (EPC). På dette punktet bør du være i stand til å visualisere Reicherts membran på plommesekken
4. Fortsett å fjerne hele decidua (lighter del) være forsiktig for ikke å pierce plommesekken
5. Forsiktig klype og fjern Reicherts ved å skrelle den bort fra EPC. Dersom EPC er skadet eller skilt fra plommesekken, vil embryo mislykkes i å slå normalt fra E8.5-E9.5

5. Sette opp kulturen systemet

1. Skjær enden av en plast overføringspipetten med saks for å øke diameteren på åpningen, slik at et embryo kan pipetteres uten å skade plommesekken
2. Fyll rene roller flasker med 1 ml av media per embryo. Avhengig av roller flasker brukt maksimalt av 3-6 embryo kan legges i hver flaske.
3. Overfør embryoene bruker kutte pipette til media fylt roller flaske, bærer over som lite Tyrodes som mulig, slik som å ikke vanne ut media
4. Fest gummi pluggen (bung) til toppen av glasset roller flaske
5. Sett valsen flaskene inn i roller kulturen trommel slik at en tett forsegling dannes mellom pluggen og trommelen
6. Når alle flasker har vært festet, og eventuelle tomme plasser i trommelen har vært forseglet wed gummi propper, aktivere valsen
7. Åpen CO ₂ og O ₂ tanker og justere dem til ca 2 psi, slik at uttaket ventilen slippe en boble per sekund. For E8.5-E10 embryo, bør 20% O ₂ og 5% CO ₂ brukes.
8. Sørg for at inkubator er satt til 37 ° C og dekker eller lukke inkubatoren slik at embryoene er skjermet mot lys.
9. Embryoer bør sjekkes regelmessig for å vurdere deres utvikling ved tillegg av somities, progresjon for å snu, og omfanget av neural tube nedleggelse
10. Etter 2-3 timer i kultur, kan farmakologiske hemmere eller andre behandlinger legges til media
11. Studien design bør omfatte kontroller, for eksempel bil eller inaktive analoger av studien reagens.

Seks. Vurderer utvikling etter hele embryo kultur

1. Slå av gass, stoppe roller, og fjerne flasker fra inkubatoren
2. Overfør embryo tilbake til Tyrodes eller PBS i en petriskål for evaluering i henhold stereomikroskop
3. Plommesekken skal vises ballong-aktig, et hjerteslag skal være synlig og hjertefrekvensen skal være> 120 slag pr min, og sirkulasjon bør være tydelig
4. Foto embryo før plommesekken fjerning hvis nødvendig
5. Fjern plommesekken fra embryo ved å skjære et hull nær EPC og blar plommesekken og amnion over hodet og krysset av embryoet.
6. Navlestrengen kan kuttes for å skille plommesekken fra fosteret, og plommesekken kan brukes til genotyping fosteret hvis nødvendig.
7. Undersøk embryo for somite antall og nevralrørsdefekter, for eksempel åpne cranial folder, ufullstendig lukking av ansikt og / eller en åpen caudal neuropore. Befruktede egg kan bli avholdt i henhold til Theiler klassifisering av flere morfogenetiske endringer ( http://www.emouseatlas.org/ eMap / home.html ) Igjen, en fotografisk oversikt overembryo utvikling er nyttig.

7. Merknader

1. En høy kvalitet disseksjon er viktig, fordi noen nick eller tårer i plommesekken vil hindre vellykket snu og hemme normal utvikling. EPC kan også bli skadet under fjerning av Reichert membran (RM), og hvis EPC er selv delvis atskilt fra plommesekken, vil foster ikke utvikler seg normalt. Imidlertid kan ufullstendig fjerning av RM årsaken embryo å holde sammen og / eller RM celler kan overgrow i kultur og constrict plommesekken utvidelse, som begge ville hindre normal utvikling.
2. Rene og skarpe tang er hemmeligheten til å få en god disseksjon, fordi kjedelig eller bøyd pinsett gjøre prosedyren betydelig vanskeligere. Protein innskudd på instrumenter vil føre til vevsskade.
3. Ren, sterile glass flasker er også viktig å hindre at embryo fester seg til sidevegg og blir skadet. Før du starter eksperimentet, bør flaskene scrubbed med såpe og vann, skylles i dH ₂ O, og microwaved med en liten mengde vann i hver flaske til vannet koker. Flasker blir deretter skylles med 70% EtOH og lov til å lufttørke.
4. Arbeid så raskt som mulig, fordi jo før jo fosteret kan bli overført til kultur media og varmet tilbake til 37 ° C de bedre overlevelse.
5. Fullfør dissecting hele kullet før du overfører noen embryoene roller flasker slik at hver embryo er ved romtemperatur for samme mengde tid på å unngå å skape eventuelle avvik i embryo vekst
6. Opprettholde et sterilt miljø for å forebygge bakteriell kontaminering av kulturer. Vår kultur eksperimenter har blitt utført uten antibiotika, men mange laboratorier legge antibiotika til sine media for å hindre bakterievekst. Mediet skal fremstå som tydelige på slutten av eksperimentet som det var i begynnelsen av eksperimentet. Hvis media har blitt overskyet eller det er en synlig bunnfall, er det sannsynligvis en conforurensningsnivå som har infisert din kultur.
7. Ineffektiv gassutveksling kan også forsinke embryo utvikling, så sørg for å ha en pålitelig regulator som skal sikre kontinuerlig levering.
8. Embryoer utvikler omtrent 50% tregere i ex vivo kultur, derfor er det viktig å telle somites å sikre at du har nådd riktig utviklingsstadium for gjennomføring av forsøket.

8. Representative resultater:

Utseendet av fostre pre-og post-roller kultur er illustrert i figur 1. På tidspunktet for disseksjon, bør embryo være i en unturned konfigurasjon (Fig. 1A, D) der halen er bak hodet folder. Etter 36 timer i kultur, bør embryo har fullført snu slik at de er i C-buede, fosterstilling, der halen er foran hodet (fig 1B, C, E, F). Farmakologiske manipulasjon med RhoA kinase inhibitor (Y-27632), en kjent hemmer av konvergent forlengelse underneurulation (Ybot-Gonzalez, 2007), resulterer i en forkortelse av embryoene langs deres rostral-caudal aksen (fig 1E, F) og hemmer cranial nevrale fold nedleggelse. Våre data viser at økende doser av Y-27632 gradvis svekker cranial fold stenging (Figur 2A) og forkorter kroppen aksen (Fig. 2B), forenlig med rollen som nedstrøms RhoA signalering i kranial neurulation og konvergent forlengelse.

Figur 1. Utseende av kulturer befruktede egg og manipulasjon med den farmakologiske inhibitor Y-27632. (A, D) dissekert embryoer på E8.5 før hele embryo kultur (B, E) embryoer på E10 med plommesekken fremdeles intakt, etter 36hrs av roller kultur. (C, F) plommesekken har blitt fjernet for å illustrere vellykket snu og nevralrørsdefekter nedleggelse. Embryoer som ble behandlet med Rho kinase inhibitor Y-27632 (E, F) unnlot å gjennomgå skikkelig konvergent forlengelse og illustrereen forkortet kropp akse.

Figur 2. Effect of RhoA kinase inhibitor på kraniale neural tube lukking og aksen tøyelighet. (A) Prosentandelen av fostre som var i stand til å lukke sine cranial folder (% NTC = prosentandel neural tube nedleggelse) er i forhold til dosen av Y-27632 lagt til kultur media. (B) Avstanden mellom otic vesicle og forbena ble betydelig redusert ved økende doser av Y-27 632 (p <0,05).

Discussion

Evnen til å skille mors, intrauterine faktorer fra de som er iboende i embryo under sin utvikling er et viktig verktøy for å studere alle stadier av embryogenesen. Her har vi analysert virkningene av en lite molekyl hemmer av RhoA kinase på kraniale neurulation ex utero, og dermed fjerne variable av mors metabolismen av stoffet. Denne farmakologisk manipulasjon har en dyp effekt på kranial neurulation og konvergent forlengelse. Følsomhet for denne forbindelsen kan sammenlignes mellom ulike genetiske mus mutanter. Metoden som presenteres her kan også brukes til studier av andre molekylære stier i utvikling, slik at direkte manipulasjon av cellular funksjon i embryo ved hjelp av en rekke av reagenser.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Stereomicroscope for Dissection	Leica Microsystems	M165
Precision Incubator	BTC Engineering	BTC 001
Rotating Bottle Culture Unit	BTC Engineering	BTC 003
Glass Bottles for Rotating Unit	BTC Engineering	BTC 005
Silicone Rubber Bung	BTC Engineering	BTC 007
Silicone Rubber Cork	BTC Engineering	BTC 008
Gas Bubbler Inlet	BTC Engineering	BTC 012
Gas Bubbler Inlet Trap	BTC Engineering	BTC 013
Gas Bubbler Outlet	BTC Engineering	BTC 014
Gas Cylinder	Tech Air		20% O2, 5% CO2
Gas Regulator	Tech Air
Male Rat Serum	Harlan Laboratories	4520
DMEM w/o phenol red	Invitrogen	31053
10 mL Syringe	BD Biosciences	309604
Syringe Filter	Nalge Nunc international	190-2545
Large Dissecting Scissors (Blunt tip)	VWR international	82027-594
Extra Fine Bonn Scissors	Fine Science Tools	14084-08
Dumot #5 forceps	Fine Science Tools	11252-50
Tyrode’s Saline			As described in Cockroft 1990
10 cm Disposable Petri Dish	BD Biosciences	351029