Summary
Метод позволяет напрямую фармакологической манипуляции эмбрионов мыши во время нейруляции в обход материнской метаболизм описаны. Методика может быть адаптирована для изучения различных аспектов нейруляции, изменяя точку времени и фармакологических агентов.
Abstract
Генетические модели мыши являются важным инструментом в изучении млекопитающих нейронных закрытия трубки (Gray & Ross, 2009; Ross, 2010). Тем не менее, исследование эмбрионов мыши внутриутробно ограничивается наша неспособность непосредственно фармакологически манипулировать эмбрионов в отрыве от последствий материнской обмен веществ на реагент интересов. Ли с помощью небольшой молекулы, рекомбинантных белков, или миРНК, доставки этих веществ к матери, через пищу или в виде инъекций подвергнет эти нестабильные соединения с различными телесными защиты, которые могут помешать им достичь эмбриона. Исследования в культурах все эмбрионы могут быть использованы для отдельных материнских от внутренней плода воздействия на развитие.
Здесь мы представляем метод культивирования эмбрионов мыши использованием обогащенного средств массовой информации в аппарат ролик инкубатор, который позволяет для нормальной нейронной закрытие трубы после вскрытия (Крокетт, 1990). Как только в культуре, эмбрионы могутможно манипулировать с использованием традиционных методов в пробирке, что не было бы возможно, если эмбрионы были еще в период внутриутробного развития. Эмбрион братья и сестры могут быть собраны в различные моменты времени для изучения различных аспектов нейруляции, происходящих из Е7-7.5 (нейронная формирование пластины, незадолго до начала нейруляции) до E9.5-10 (при заключении черепной раза и хвостового нейропоры закрытие, Кауфман, 1992). В этом протоколе, мы демонстрируем наш метод вскрытия эмбрионов на timepoints, оптимальные для изучения черепа нейруляции. Эмбрионы будут расчлененный на E8.5 (около 10-12 somities), после возбуждения нейронных закрытия трубки, но до поворота эмбриона и черепно нейронных раза закрытия, и поддерживаться в культуре до E10 (26-28 somities), когда черепные нейруляции должна быть полной.
Protocol
1. Подготовка медиа-культуры - все реагенты, перечислены в таблице 1
- Оттепель мужской сыворотке крыс при 37 ° C.
- Тепло-Деактивировать крысы сыворотки в течение 30 минут при 55 ° С
- Центрифуга крысы сыворотки на 10 тыс. в течение 5 минут при комнатной температуре
- Удалить супернатант и смешать с 50:50 фенол-красный свободной DMEM ж / высокий уровень глюкозы в
- Стерилизовать массовой информации, использующих 0,45 мкм фильтр шприца
- По крайней мере, 1 мл средства массовой информации / эмбрион должен быть готов
2. Выделение из матки беременной плотины
- Использование процедуры, утвержденные по Уходу за животными и использованию комитета (IACUC), беременных плотина первой анестезии, а затем умерщвляли цервикальным сдвигом
- Стерилизовать живота с 70% этанола
- Pinch небольшой путь кожу вдоль средней линии, чуть выше линии сосков, с большими щипцами и открытой брюшной полости под вашим щипцы с большими ножницами. Будьте осторожны, чтобы не повредить внутреннюю структуруы
- Используйте ножницы, чтобы вырезать с боков от начального открытия к каждой стороне мыши так, чтобы весь живот открытым
- Кишечник и избыток жировых отложений часто неясных матки, и они должны быть перемещены в сторону так, что верхняя часть матки и яичников может наблюдаться на каждой стороне
- Pinch верхней части матки ниже яичников и использовать ножницы, чтобы отдельные матки от жира, режущий из одного конца матку другой яичник
- Выньте матки с пинцетом и поместить в чашку Петри с солевым
3. Удаление эмбрионов из матки
- Промыть матки физиологическим раствором, чтобы удалить лишнюю кровь и отделка любой лишний жир с внешней стороны
- Трансфер в чистую посуду с комнатной температуре. Tyrodes физиологическим раствором для улучшения визуализации
- Использование стереомикроскопа, отдельно каждый эмбрион, используя либо маленькие ножницы или, при необходимости мелкий (# 5) щипцов тщательно очистить матку друг от друга. <Li> Вставить штраф пинцет в пространство между стенки матки и децидуальной и отогните стенки матки, стараясь не проколоть эмбриона
4. Удаление децидуальной из эмбрионов
- Восток децидуальной так, чтобы темные части (плаценты) отворачивается от вас
- Сделайте разрез с вашими пинцетом вдоль линии, отделяющей темную часть децидуальной из легких части, стараясь не зайти слишком далеко
- Полное отделение плаценты от верхней части желточного мешка, стараясь не порвать ectoplacental конуса (EPC). В этот момент вы должны быть в состоянии представить себе Reicherts мембрану на желточного мешка
- Продолжая снимать весь децидуальной (светлее часть) стараясь не проколоть желточного мешка
- Аккуратно шнура и удалить Reicherts путем снятия его подальше от EPC. Если EPC поврежден или отделить от желтка, эмбрионы не удастся превратить в нормальном режиме от E8.5-E9.5
5. Настройка системы культуры
- Отрежьте конец пластиковой пипетки передача с ножницами, чтобы увеличить диаметр отверстия, так что эмбрион может быть пипеткой, не повреждая желтка
- Заполните чистые бутылки ролик с 1 мл среды в эмбрионе. В зависимости от типа роликов бутылок, используемых максимум 3-6 эмбрионов могут быть загружены в каждой бутылке.
- Передача эмбрионы с помощью пипетки, чтобы сократить медиа-ролика заполнены бутылки, перенос всего Tyrodes возможно, чтобы не разбавлять СМИ
- Прикрепите резиновые пробки (пробка) для верхней части бутылки ролик стекла
- Вставить ролик бутылок в барабан культуры валик так, чтобы уплотнение образуется между зажигания и барабан
- После того как все бутылки были прикреплены, и любые пустые слоты в барабане были опечатаны шго пробки резиновые, активировать ролик
- Открытое СО 2 и О 2 танка и скорректировать их около 2 фунтов на квадратный дюйм, так что выпускной клапан выпускает один пузырек в секунду. Для E8.5-E10 эмбрионов, 20% O 2 и 5% CO 2 должен быть использован.
- Убедитесь, что инкубатор установлен до 37 ° С и покрывают или закрыть инкубатор так, что эмбрионы защищены от света.
- Эмбрионы должны периодически проверяться, чтобы оценить их развития путем добавления somities, прогрессирование поворота, а также степень нейронных закрытия трубки
- Через 2-3 часов в культуре, фармакологические ингибиторы или другие виды лечения могут быть добавлены в СМИ
- Дизайн исследования должны включать в себя элементы управления, такие как автомобиль или неактивные аналоги исследования реагента.
6. Оценка развития после целой культуры эмбриона
- Выключите газ, остановить ролик, и удалить бутылки из инкубатора
- Трансфер эмбрионов обратно в Tyrodeс или PBS в чашке Петри для оценки в соответствии с стереомикроскопа
- Желточного мешка должно появиться подобное баллону, сердцебиение должны быть видны и частота сердечных сокращений должна быть> 120 ударов в минуту, и обращение должно быть очевидным
- Фотография эмбрионов перед удалением желточного мешка при необходимости
- Удалить из желточного мешка эмбриона за счет сокращения отверстие рядом EPC и листать желточный мешок и амнион по голове и крупе эмбриона.
- Пуповины можно отрезать по отдельным желточного мешка из эмбриона и желточного мешка могут быть использованы для генотипирования эмбриона, если необходимо.
- Изучите эмбриона число сомитов и дефектов нервной трубки, таких как открытые черепно складки, неполное закрытие лица и / или открытых хвостового нейропоры. Эмбрионы могут быть организованы в соответствии с классификацией Theiler нескольких изменений морфогенетических ( http://www.emouseatlas.org/ EMAP / home.html ) Опять же, фотографическая записьразвитие эмбриона является полезным.
7. Примечания
- Высокая диссекция качества имеет важное значение, потому что любой ник или слезы в желточный мешок будет препятствовать успешной поворота и тормозят нормальное развитие. EPC также может быть поврежден во время удаления мембраны Reichert (в ГРМ), и если EPC хотя бы частично отделить от желтка, эмбрионы не будут нормально развиваться. Тем не менее, неполное удаление RM может вызвать эмбрионов держаться вместе и / или RM клетки могут перерасти в области культуры и сужают желточного мешка расширения, каждый из которых будет препятствовать нормальному развитию.
- Чистота и резкое щипцы являются тайной для получения хорошего рассечение, потому что скучно или изогнутые щипцы делают процедуру значительно сложнее. Белковых отложений на инструментах приведет к повреждению тканей.
- Чистый, стерильные стеклянные бутылки также имеют важное значение для предотвращения эмбрионов от прилипания к боковой стенке и повреждений. До начала эксперимента, бутылки должны быть экрubbed с мылом и водой, промыть в дН 2 O, и микроволновой печи с небольшим количеством воды в каждой бутылке, пока вода не закипит. Бутылки затем промыть 70% этанола и позволил высохнуть на воздухе.
- Работа как можно быстрее, потому что рано эмбриона могут быть переданы на культуру средств массовой информации и нагревают назад до 37 ° C лучшую выживаемость.
- Полное рассекает весь помет до передачи любых эмбрионов на роликах бутылки так, чтобы каждый эмбрион при комнатной температуре на столько же времени, чтобы избежать создания каких-либо расхождений в рост зародыша
- Поддерживать стерильной среде, чтобы предотвратить бактериальное загрязнение культур. Наши эксперименты культуры были выполнены без применения антибиотиков, но многие лаборатории добавить антибиотик их информации в целях предотвращения роста бактерий. Среда должна выглядеть как ясно в конце эксперимента, как это было в начале эксперимента. Если средства массовой информации становятся мутными или есть видимый осадок, существует вероятность конзагрязнение, который заразил своей культуры.
- Неэффективные газообмена может также задержать развитие эмбрионов, так что будьте уверены, чтобы иметь надежный регулятор, который позволит обеспечить поставки.
- Эмбрионы развиваться примерно на 50% медленнее в бывшей культуры естественных условиях, поэтому необходимо рассчитывать сомитов, чтобы вы достигли соответствующего этапа развития для завершения эксперимента.
8. Представитель результаты:
Появление эмбрионов пред-и пост-ролик культуры иллюстрируется на рисунке 1. Во время вскрытия, эмбрионы должны быть в камне конфигурации (рис. 1А, D), где хвост позади головы складок. После 36 часов в культуре, эмбрионы должны завершить поворот так, что они находятся в C-изогнутые, положение плода, где хвост находится в передней части головы (рис. 1б, C, E, F). Фармакологические манипуляции с RhoA киназы ингибитор (Y-27632), известный ингибитор расширению конвергентного во времянейруляции (Ybot-Gonzalez, 2007), приводит к сокращению эмбрионов вдоль их ростральной-каудальной оси (рис. 1E, F) и тормозит черепной нейронных раза закрытия. Наши данные показывают, что увеличение дозы Y-27632 постепенно ухудшает черепной раза закрытия (рис. 2A) и сокращает оси тела (рис. 2В), в соответствии с ролью вниз по течению RhoA сигнализации в черепной нейруляции и конвергентных расширение.
Рисунок 1. Внешний вид культур эмбрионов и манипуляций с фармакологических ингибиторов Y-27632. (A, D) расчлененный эмбрионов на E8.5 до целой культуры эмбриона (В, Е) Эмбрионы на E10 с желточного мешка еще цела, после 36hrs роликовых культуры. (C, F) желточного мешка была удалена, чтобы показать успешный поворот и нейронных закрытия трубки. Эмбрионы, которые лечили ингибитором Rho киназ Y-27632 (E, F), не прошедших надлежащего расширению конвергентного и проиллюстрироватьукороченной оси тела.
Рисунок 2. Влияние ингибиторов киназы RhoA на черепные нейронных закрытия трубы и оси удлинения. (А) процент эмбрионов, которые смогли успешно закрывают черепных складок (NTC% = процент нейронных закрытия трубка) по сравнению с дозой Y-27632 добавили в культуру средств массовой информации. (Б) расстояние между слуховым пузырьком и передних конечностей было значительно снижено в увеличении доз Y-27632 (р <0,05).
Discussion
Способность отдельных материнской, внутриутробной факторов от тех, которые присущи эмбриона в ходе его разработки является важным инструментом для изучения всех стадиях эмбриогенеза. Здесь мы проанализировали эффект небольшой молекулы ингибитора из RhoA киназы на черепные внутриутробно бывший нейруляции, удаляя таким образом переменная материнской метаболизма препарата. Это фармакологических манипуляций оказывает сильное влияние на черепные нейруляции и конвергентных расширение. Чувствительность к этому соединению можно сравнить между различными генетическими мутантами мыши. Метод, представленный здесь также может быть применен к изучению других молекулярных путей в развитии, что позволяет прямое манипулирование клеточную функцию в эмбрионах с помощью различных реагентов.
Disclosures
Нет конфликта интересов объявлены.
Acknowledgments
Мы хотели бы поблагодарить лабораторию А. Hadjantonakis (Sloan-Kettering Institute) и лаборатории Л. Niswander (U Колорадо-Денвера) за полезные советы с рассечением и культуры методов. Эта работа была поддержана НРСА NS059562 к JDG и RO1NS05897 к РВК в сотрудничестве с Л. Niswander и Дж. Nadeau (Институт системной биологии).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Stereomicroscope for Dissection | Leica Microsystems | M165 | |
| Precision Incubator | BTC Engineering | BTC 001 | |
| Rotating Bottle Culture Unit | BTC Engineering | BTC 003 | |
| Glass Bottles for Rotating Unit | BTC Engineering | BTC 005 | |
| Silicone Rubber Bung | BTC Engineering | BTC 007 | |
| Silicone Rubber Cork | BTC Engineering | BTC 008 | |
| Gas Bubbler Inlet | BTC Engineering | BTC 012 | |
| Gas Bubbler Inlet Trap | BTC Engineering | BTC 013 | |
| Gas Bubbler Outlet | BTC Engineering | BTC 014 | |
| Gas Cylinder | Tech Air | 20% O2, 5% CO2 | |
| Gas Regulator | Tech Air | ||
| Male Rat Serum | Harlan Laboratories | 4520 | |
| DMEM w/o phenol red | Invitrogen | 31053 | |
| 10 mL Syringe | BD Biosciences | 309604 | |
| Syringe Filter | Nalge Nunc international | 190-2545 | |
| Large Dissecting Scissors (Blunt tip) | VWR international | 82027-594 | |
| Extra Fine Bonn Scissors | Fine Science Tools | 14084-08 | |
| Dumot #5 forceps | Fine Science Tools | 11252-50 | |
| Tyrode’s Saline | As described in Cockroft 1990 | ||
| 10 cm Disposable Petri Dish | BD Biosciences | 351029 |
References
- Cockroft, D. L. Dissection and culture of post implantation embryos. Mammalian Postimplantation Embryos A Practical Approach. Copp, A. J., Cockroft, D. L. , IRL Press. Oxford. (1990).
- Gray, J. D., Ross, M. E. Mechanistic insights into folate supplementation from Crooked tail and other NTD-prone mutant mice. Birth Defects Res. A. Clin. Mol. Teratol. 85, 314-321 (2009).
- Kaufman, M. H. The Atlas of Mouse Development. , Academic Press Limited. San Diego. (1992).
- Ybot-Gonzalez, P., Savery, D., Gerrelli, D., Signore, M., Mitchell, C. E., Faux, C. H., Greene, N. D., Copp, A. J. Convergent extension, planar-cell-polarity signalling and initiation of mouse neural tube closure. Development. 134, 789-799 (2007).
- Ross, M. E. Gene-environment interactions, folate metabolism and the embryonic nervous system. Wiley Interdiscip Rev Syst Biol Med. 2, 471-480 (2010).
