Profiling Voltage-gated kalium kanaal mRNA expressie in Nigral Neuronen met behulp van Single-cell RT-PCR-technieken

Summary

Neuronen zijn in de eerste elektrofysiologische gekarakteriseerd. Dan het cytoplasma van de opgenomen neuron is opgezogen en onderworpen aan transcriptie-PCR analyse achteruit om de expressie van mRNA's voor de neurotransmitters synthese enzymen, ion kanalen en receptoren op te sporen.

Abstract

In centrale zenuwstelsel, zijn verschillende soorten neuronen met verschillende moleculaire en functionele eigenschappen vermengd met elkaar, moeilijk te scheiden en ook niet gemakkelijk te herkennen aan hun morfologie. Zo is het vaak moeilijk om genexpressie te analyseren in een specifiek neuron type. Hier hebben we een document procedure die whole-cell patch clamp opnamen technieken combineert met een single-cell reverse transcriptie polymerase chain reaction (scRT-PCR) naar het profiel van mRNA expressie in verschillende types van neuronen in de grote nigra. Elektrofysiologische technieken worden voor het eerst gebruikt om de neurofysiologische en functionele eigenschappen van individuele neuronen te nemen. Dan is het cytoplasma van een elektrofysiologische gekenmerkt nigral neuronen afgezogen en onderworpen aan scRT-PCR-analyse mRNA-expressie profielen te verkrijgen voor neurotransmitters synthese enzymen, receptoren en ionkanalen. De hoge selectiviteit en gevoeligheid maakt deze methode met name handig als immunohistochemie kan niet te wijten aan een gebrek aan geschikte antilichaam of lage expressie-niveau van het eiwit worden gebruikt. Deze methode is ook toepasbaar op neuronen in andere hersengebieden.

Protocol

1. Brain slice voorbereiding

1. Jonge (15-40 dagen oud) mannelijke en vrouwelijke Sprague-Dawley ratten worden gebruikt. (We gebruiken deze zelfde protocol bij muizen.) Onder diepe narcose urethaan, zijn dieren onthoofd en de hersenen is snel ontleed uit. Dan 300 micrometer dik coronale hersenen plakken met de midrostral deel van substantia nigra worden gesneden op een Leica vibratome (VT-1200S). De slice snijden procedure wordt uitgevoerd in een ijskoude, zuurstofrijke hoge sucrose snijden oplossing die (in mm): 220 sucrose, 2,5 KCl, 1,25 NaH ₂ PO _4, 25 NaHCO _3, 0,5 CaCl _2, 7 MgCl _2, 10 D- glucose. Het is borrelen met een mengsel van 95% O ₂ / 5% CO ₂ te houden zuurstof en onderhouden van pH 7,4. Houd de snij-oplossing ijskoude tijdens de gehele procedure.
2. De hersenen plakjes worden geïncubeerd in een incubatie kamer gevuld met een zuurstofrijke kunstmatige cerebrospinale vloeistof (aCSF) die (in mm): 125 NaCl, KCl 2,5, 1,25 NaH ₂ PO _4, 25 NaHCO _3, 2,5 _CaCl2, 1,3 MgCl _2, 10 D-glucose. Het is borrelen met een mengsel van 95% O ₂ / 5% CO ₂ te houden zuurstof en onderhouden van pH 7,4. De incubatie temperatuur is 34 ° C gedurende 45 minuten en daarna bij kamertemperatuur totdat de hersenen slice wordt overgedragen aan de opname kamer.

2. Elektrofysiologische vingerafdrukken van nigral neuronen

1. Een van de hersenen slice is overgebracht naar een patch clamp opname kamer continu geperfuseerd met de zuurstofrijke aCSF bij 32 ° C.
2. Patch pipetten worden getrokken uit geautoclaveerd borosilicaat (KG-33) glazen capillaire buis (1,10 mm id, 1,65 mm od, King Precision Glass, Claremont, Californië) met behulp van een PC-10 trekker (Narishige, Tokyo, Japan) en gevuld met intracellulaire oplossing bereid met DNase-RNase-vrij water (Fisher Scientific) (met 135 mM KCl, 0,5 mM EGTA, 10 mM HEPES, 1,5 mM _MgCl2, pH ingesteld op 7.3). De patch pipetten hebben weerstanden van 2-3 MΩ in het bad.
3. De substantia nigra is geïdentificeerd aan de hand zijn verschillende anatomische locatie (afb. 1A1-2). Onder visuele begeleiding van een video-microscoop (Olympus BX51W1), uitgerust met Nomarski optiek en 60X water immersie-lens, grote cellen in de substantia nigra pars compacta (SNC) en de substantia nigra pars reticulata (SNR) (mogelijke DA neuronen en GABA neuronen) zijn geselecteerd voor opname. Conventionele giga-ohm afdichting whole-cell configuratie wordt verkregen (Fig. 1B1). Stroomtang en spanning klem analyses kunnen worden uitgevoerd. Te minimaliseren mRNA degradatie, moet elektrofysiologische opname kort zijn (≤ 5 min). Een optie is om alleen de membraan en stekelige eigenschappen opnemen elektrofysiologische vingerafdrukken te laten afnemen voor de neuronen van de belangen (afb. B2-3). Deze korte opname duurt slechts ongeveer een minuut.

3. Cytoplasma aspiratie

1. Na de elektrofysiologische fingerprinting en karakterisering van SNR GABA en DA neuronen, is zacht mond zuigkracht toegepast op het cytoplasma zuigen. De celkern kan ook worden opgezogen, wat resulteert in genomisch DNA besmetting. De goede afdichting mag niet worden gebroken, anders extracellulaire puin waaronder mRNA kan worden gezogen in de patch pipet en vervuilen van de celinhoud. De integriteit van de strakke afsluiting is goed, zolang de toename van het houdstroom bij -70 mV niet meer dan 100 pA.
2. Dan is de geaspireerde celinhoud wordt uitgestoten in een 0,2 ml PCR-buis door het breken van de pipetpunt en een kleine positieve druk. Een cel content is verzameld in een PCR-buis. Na aanvaarding van de celinhoud, het verzamelen PCR tube, pre-gekoeld op ijs, wordt direct geplaatst in een -20 ° C vriezer.
3. Om uit te sluiten besmetting van extracellulaire puin kan bevatten mRNA's, is de patch pipet zakken in het weefsel, zonder echt opzuigen cytoplasma en vervolgens de pipet inhoud is onderworpen aan RT-PCR.

4. Reverse transcriptie (RT)

1. Na het verzamelen van de celinhoud van een redelijk aantal neuronen, meestal 10-20, moet RT onmiddellijk begint met de afbraak van mRNA's te minimaliseren.
2. Omdat de hoeveelheid van de cel inhoud van een enkele neuron te klein is, is het RNA-isolatie procedure niet uitgevoerd. Voor het verwijderen van de mogelijke besmetting van genomisch DNA, wordt de aangezogen cel inhoud eerst verteerd door DNase I (5 microliter DNase I en 1,6 pi DNase I Buffer, 5 min bij 25 ° C). Dan DNase I wordt geïnactiveerd door toevoeging van 1,2 pi 25 mM EDTA en incuberen bij 75 ° C gedurende 5 minuten.
3. cDNA wordt gesynthetiseerd met behulp van de SuperScript III reverse transcriptase-gebaseerde cellen-Direct cDNA synthese kit (Invitrogen, tabel 1). Eerste streng cDNA wordt gesynthetiseerd bij 50 ° C gedurende 50 min, dan is de reactie wordt geïnactiveerd door incubatie bij 85 ° C gedurende 5 minuten en 1 pi RNase H is toe te voegened naar mRNA (37 ° C gedurende 20 min) te verteren. Het enkelstrengs cDNA is opgeslagen bij -20 ° C voor later PCR-amplificatie.
4. Volledige verwijdering van genomisch DNA wordt geverifieerd door RT-minus-controle, waarin de reverse transcriptase wordt weggelaten terwijl alle andere reacties componenten zijn precies hetzelfde.

5. Tweetraps PCR-amplificatie

1. Primers werden ontworpen op basis van de sequenties in GenBank. Waar mogelijk werden de intron-spanning primerparen gebruikt die helpen genomisch DNA contaminatie op te sporen. Primerpaar sequenties zijn vermeld in tabel 2. De effectiviteit van de primerparen moet eerst worden geverifieerd door het hele brein mRNA's die positieve producten opleveren. Alle primers worden gesynthetiseerd door Integrated DNA Technologies (Coralville, Iowa, USA).
2. In de eerste fase, is 5 pi van de 30 pi cDNA geamplificeerd voor 35 cycli in de aanwezigheid van primer paar (tabel 2). De thermische cycli protocol van de thermal cycler (MasterCycler, Eppendorf, tabel 1) is 2 min bij 94 ° C voor de initiële denaturatie, vervolgens 35 cycli van 15 s bij 94 ° C denatureren, 30 s bij 55 ° C te gloeien, en 45 s bij 72 ° C uit te breiden, gevolgd door 7 min voor een laatste verlenging. Taq DNA-polymerase, deoxynucleotide trifosfaten (dNTPs), en alle andere componenten die nodig zijn voor de PCR-amplificatie worden geleverd door een PCR super mix (Invitrogen, tabel 1)
3. In de tweede fase PCR, is het product van een pi van de 1 ^e fase PCR-amplificatie gebruikt als template en dezelfde primerpaar gebruikt in de eerste fase wordt gebruikt (tabel 2). 40 cycli worden uitgevoerd met de extensie tijd ingekort tot 30 s. Dezelfde PCR super mix wordt gebruikt.
4. PCR-producten uit de 2 ^e fase versterking worden van elkaar gescheiden door 2,5% agarose gelelektroforese, gevisualiseerd door ethidiumbromide (0,05 mg/100 ml gel) of gelgreen onder UV-licht, en gefotografeerd (fig. B4). De positieve banden worden vervolgens uitgesneden, geëxtraheerd met behulp van een Qiagen extractie kit (tabel 1) en gesequenced en vergeleken met de gepubliceerde sequenties van het doel genen.

6. Representatieve resultaten:

De dopamine (DA) neuronen in de substantia nigra pars compacta en pars reticulata en de naburige GABA projectie neuronen in de substantia nigra pars reticulata hebben verschillende elektrofysiologische eigenschappen (Zhou et al., 2006;. Ding et al. 2011.). Zoals getoond in Fig. 1B2, SNR GABA neuronen vertonen een hoge frequentie spontane pieken rond de 10 Hz. De spikes hebben een basis duur van ongeveer 1 ms. Bij hyperpolarizing huidige injectie, SNR GABA neuronen weer een zwakke depolariserende zakken in reactie op de huidige hyperpolarizing injectie, wat wijst op een zwakke expressie van I _h stroom in deze neuronen (Fig. 1B2). In tegenstelling, de nigral DA neuronen vertonen een lage frequentie (ongeveer 2 Hz) spontaan pieken die een basis duur ongeveer 3 ms hebben. DA neuronen tonen ook een uitgesproken zakken in reactie op de huidige hyperpolarizing injectie, wat wijst op een sterke expressie van I _h stroom (Fig. 1B3) (Zhou et al., 2006;.. Ding et al. 2011).

scRT-PCR gedetecteerd mRNA voor glutaminezuur decarboxylase 1 (GAD1, de belangrijkste enzym voor GABA synthese en een marker voor GABA neuronen) in elektrofysiologische geïdentificeerd SNR GABA neuronen, maar niet in DA neuronen (Fig. 1B4, 5). In tegenstelling, scRT-PCR gedetecteerd mRNA voor tyrosine hydroxylase (TH, de belangrijkste enzym voor de dopamine synthese en een marker voor DA neuronen) in electrofysiologisch geïdentificeerd SNC en SNR DA neuronen, maar niet in GABA neuronen (Fig. 1B4, 5). Dus scRT-PCR-resultaten bevestigen de elektrofysiologische neuron identificatie. Vervolgens werd scRT-PCR gebruikt om de uitdrukking van de voltage-geactiveerde KV3 kanaal subeenheden, Kv3.1, Kv3.2, Kv3.3 en Kv3.4 profiel. Deze subeenheden bijdragen aan de voltage-gated K ⁺ kanalen vorm van verschillende eigenschappen, afhankelijk van subunit samenstelling (Ding et al.. 2011). In het voorbeeld SNR GABA neuron getoond in Fig. 1B4, mRNA's voor Kv3.1, Kv3.2, Kv3.3 en Kv3.4 werden gedetecteerd. In het voorbeeld SNR DA neuron afgebeeld in Fig.1B5, alleen Kv3.2, Kv3.3 en Kv3.4 werden gedetecteerd. In onze gepoolde gegevens, was Kv3.1 vaker aangetroffen in SNR GABA neuronen dan in nigral DA neuronen, wat wijst op een hogere expressie niveau van Kv3.1 in de snel-spiking SNR GABA neuronen (Ding et al.. 2011).

Figuur 1. Elektrofysiologische identificatie van SNR GABA neuronen en nigral DA neuronen A:.. Nigral gebieden kunnen worden geïdentificeerd door hun verschillende anatomische locatie A1 toont de locatie van de SNC en SNR in een coronale Nissl gekleurd gedeelte zijn gemaakt met een 1X doelstelling. De boxed gebied werd captured met een 10x objectief en weergegeven in het midden zoals aangegeven door de pijl. De cel-rijke SNc en cel-slechte SNR zijn duidelijk zichtbaar. A2 toont de locatie van de SNC en SNR in een live, onbesmet coronale gedeelte zijn gemaakt met een 4X doelstelling. De cel-rijke SNc en cel-slechte SNR zijn ook duidelijk herkenbaar. VTA, ventrale tegmentale gebied. B1 toont een SNR GABA neuron wordt patch vastgeklemd in whole-cell-modus. B2 toont de typische elektrofysiologische eigenschappen van SNR GABA neuronen in de huidige klem opnamemodus. Deze neuronen vuren spontane hoge frequentie actiepotentiaal van korte duur en hebben een zwakke I _{h-gemedieerde} verzakken reactie op hyperpolarizing huidige injectie. B3 laat de typische elektrofysiologische eigenschappen van nigral DA neuronen in de huidige klem opnamemodus. Ze vuur spontane lage frequentie actiepotentialen van lange duur en hebben een prominente I _{h-gemedieerde} sag (pijlpunt) reactie op de huidige hyperpolarizing injectie. Zo worden SNR GABA neuronen en nigral dopamine neuronen duidelijk elektrofysiologische geïdentificeerd. B4 geeft een beeld van de gel scRT-PCR-producten van een elektrofysiologische geïdentificeerd SNR GABA neuron. Glutamaat decarboxylase 1 (GAD1) ​​mRNA, maar geen Tyrosine hydroxylase (TH) mRNA werd gedetecteerd. mRNA's voor Kv3.1, Kv3.2, Kv3.3 en Kv3.4 werden ontdekt in deze SNR GABA neuron. B5 toont scRT-PCR detectie van neuronale KV3 kanaal mRNA's in een SNR DA neuron. TH mRNA maar geen GAD1 mRNA werd gedetecteerd in een elektrofysiologische geïdentificeerd SNR DA neuron. mRNA's voor Kv3.2, Kv3.3 en Kv3.4 werden ontdekt in deze SNR DA neuron. B6 shows gepoolde gegevens.

7. Potentiële vals-negatieve en vals positieve resultaten

Gebaseerd op onze ervaring, kunnen verschillende factoren die leiden tot vals negatieve scRT-PCR-resultaten. Deze factoren omvatten storing in opzuigen voldoende hoeveelheid van het cytoplasma als gevolg van pipetpunt verstopping, RNase vervuiling, en inefficiënt PCR-primers patch. Patch pipetpunt verstopping meestal is te zien op de video-monitor en wordt aangegeven door een betere toegang weerstand. RNase besmetting kan worden voorkomen door een grondige deactiveren en het dragen van handschoenen. PCR-primer effectiviteit moet worden getest met behulp van totaal RNA van een hersenweefsel punch (Zhou et al., 2008;.. Ding et al. 2011).

Aangezien wij altijd gebruik maken van DNase om eerst onze monsters behandelen voordat RT, hebben we niet tegengekomen vals-positieve resultaten. Theoretisch, zonder DNase spijsvertering, werkt genomisch DNA vervuiling en dus vals positieve detectie kan optreden wanneer het gen is intronless of de primerpaar niet spanwijdte van de intron regio.

Discussion

De combinatie van patch clamp opnamen in de hersenen slice met scRT-PCR toonden we hier een uitstekende methode om de mRNA-expressie-profielen te onderzoeken voor de ion kanalen, receptoren, en de belangrijkste enzymen voor neurotransmitters synthese in individueel gekarakteriseerd neuronen. Dit is vooral handig wanneer het eiwit in kwestie niet kan worden gedetecteerd en gelokaliseerd met behulp van andere methoden zoals immunohistochemie te wijten aan lage expressie-niveau en / of gebrek aan geschikte antilichaam (Surmeier et al., 1996;.. Zhou et al. 2009). De hoge gevoeligheid en selectiviteit van scRT-PCR kan de detectie van lage overvloed mRNAs (Surmeier et al.. 1996). Bovendien is deze methode kan de correlatie van genexpressie met elektrofysiologische en functionele eigenschappen in individueel gekarakteriseerd neuronen (Liss et al., 2001;. Zhou et al. 2008, 2009;. Ding et al. 2011.). Op basis van de literatuur bewijs en onze ervaring, deze methode is van toepassing op iedere neuron types in het zenuwstelsel.

Materials

Table 1. Key reagents and equipment

Table 2. Primer pairs for rat neuronal Kv3 channel, tyrosine hydroxylase (TH) and glutamic acid decarboxylase 1 (GAD1) mRNAs for scRT-PCR