Summary
وتتميز الخلايا العصبية electrophysiologically first. ثم يستنشق السيتوبلازم من الخلايا العصبية المسجلة وتعرض لعكس النسخ PCR تحليل للكشف عن التعبير عن mRNAs للأنزيمات التوليف العصبي ، وقنوات ايون ، والمستقبلات.
Abstract
الثدييات في النظام العصبي المركزي ، وتختلط أنواع مختلفة من الخلايا العصبية مع مختلف الخصائص الجزيئية والوظيفية مع بعضها صعب ، وغيرها ، وكذلك لفصل لم يتم التعرف بسهولة عن طريق التشكل بهم. وهكذا ، فإنه غالبا ما يكون من الصعب تحليل التعبير الجيني في الخلايا العصبية من نوع معين. نحن هنا وثيقة إجراء من شأنه أن يجمع بين خلية كاملة تقنيات تسجيل التصحيح مع المشبك وحيدة الخلية تفاعل البلمرة عكس النسخ (scRT - PCR) للتعبير عن التعريف مرنا في أنواع مختلفة من الخلايا العصبية في أسود كبير. واستخدم لأول مرة تقنيات الكهربية لتسجيل خصائص العصبية والوظيفية للخلايا العصبية الفردية. إذن ، هو أن يستنشق السيتوبلازم من الخلايا العصبية واحدة تتميز nigral electrophysiologically وتعرض لscRT - PCR تحليل للحصول على ملامح التعبير مرنا للأنزيمات التوليف العصبي ، والمستقبلات ، وقنوات أيون. انتقائية عالية وحساسية تجعل هذه الطريقة مفيدة بشكل خاص عندما لا يمكن المناعية يمكن استخدامها نظرا لعدم وجود أجسام مضادة مناسبة أو انخفاض مستوى التعبير من البروتين. هذا الأسلوب ينطبق أيضا على الخلايا العصبية في مناطق أخرى من الدماغ.
Protocol
1. إعداد شريحة الدماغ
- الشباب (15-40 يوما) وتستخدم للذكور والإناث ، سبراغ داولي الفئران. (ونحن أيضا استخدام هذا البروتوكول نفسه في الفئران.) تحت التخدير يوريتان العميق ، ومقطوعة الرأس ويتم تشريح الحيوانات بسرعة إلى المخ. ثم يتم قطع 300 ميكرون سميكة تحتوي على شرائح الدماغ الاكليلية midrostral الجزء من المادة السوداء على vibratome ايكا (VT - 1200S). يتم تنفيذ الإجراء شريحة القطع في السكروز الجليد الباردة ، وارتفاع القطع محلول يحتوي على الاوكسيجين (مم) : 220 السكروز ، 2.5 بوكل ، 1.25 ناه 2 ص 4 ، 25 NaHCO 3 ، 0،5 CaCl 2 ، 7 MgCl 2 ، D - 10 الجلوكوز. وانفجر مع خليط من 95 ٪ O CO 2 / 2 5 ٪ للحفاظ على الاوكسيجين والحفاظ على درجة الحموضة في 7.4. يبقي الحل قطع الجليد الباردة طوال الإجراء.
- يتم تحضين شرائح الدماغ في غرفة مليئة الحضانة مع الاوكسيجين السائل النخاعي الاصطناعي (aCSF) التي تحتوي على (مم) : 125 كلوريد الصوديوم ، 2.5 بوكل ، 1.25 ناه 2 ص 4 ، 25 NaHCO 3 ، 2 CaCl 2.5 ، 1.3 MgCl 2 ، 10 D - الجلوكوز. وانفجر مع خليط من 95 ٪ O CO 2 / 2 5 ٪ للحفاظ على الاوكسيجين والحفاظ على درجة الحموضة في 7.4. درجة حرارة الحضانة هي 34 درجة مئوية لمدة 45 دقيقة ثم في درجة حرارة الغرفة حتى يتم نقل شريحة الدماغ إلى غرفة تسجيل.
2. البصمات الكهربية للخلايا العصبية nigral
- شريحة واحدة يتم نقل الدماغ لتسجيل غرفة التصحيح المشبك perfused باستمرار مع aCSF الاوكسيجين في 32 درجة مئوية.
- يتم سحبها ماصات التصحيح من البورسليكات تعقيمها (KG - 33) أنابيب الزجاج الشعرية (1.10 ملم معرف ، 1.65 ملم التطوير التنظيمي ، الملك الدقة للزجاج ، كليرمونت ، كاليفورنيا) باستخدام مجتذب PC - 10 (Narishige ، طوكيو ، اليابان) ، ومليئة حل جواني مع استعداد الدناز - ريبونوكلياز خالية من المياه (فيشر العلمية) (135 ملم تحتوي على بوكل ، 0.5 ملي EGTA ، 10 HEPES ملم ، 1.5 ملم MgCl 2 ، ودرجة الحموضة تعديلها إلى 7.3). وماصات التصحيح والمقاومة من 2-3 MΩ في الحمام.
- وحددت المادة السوداء وفقا لموقعها التشريحي متميزة (الشكل 1A1 - 2). بتوجيه البصرية المجهر الفيديو (أوليمبوس BX51W1) مجهزة Nomarski البصريات والعدسات 60X الغمر بالمياه ، والخلايا الكبيرة في المكتنزة substantia بارس أسود (SNC) ، والمادة السوداء الجزء الشبكي (الأب) (DA ممكن الخلايا العصبية والخلايا العصبية GABA) ويتم اختيار للتسجيل. يتم الحصول على GIGA أوم ضيق التقليدية ختم خلية كاملة التكوين (الشكل 1B1). يمكن إجراء التحليلات الحالية المشبك المشبك والجهد. للحد من تدهور مرنا ، ينبغي تسجيل الكهربية الإيجاز (≤ 5 دقائق). خيار واحد هو السجل الوحيد الغشاء وخصائص التشويك لتقديم بصمات الكهربية للخلايا العصبية للمصالح (الشكل B2 - 3). هذا التسجيل وجيزة فقط يستغرق حوالي 1 دقيقة.
3. السيتوبلازم الطموح
- بعد أخذ البصمات الكهربية وتوصيف SNR GABA والخلايا العصبية DA ، يتم تطبيق طيف الامتصاص الفم لنضح السيتوبلازم. ويمكن أيضا أن تكون نواة الخلية يستنشق ، مما أدى إلى تلوث الحمض النووي الجيني. لا ينبغي أن تكون مكسورة ختم ضيقة ، وقد يكون خلاف ذلك امتص الحطام خارج الخلية بما في ذلك مرنا في ماصة التصحيح وتلويث محتويات الخلية. وختم سلامة مشددة جيدة طالما أن الزيادة في عقد الحالي في -70 بالسيارات لا يتجاوز 100 السلطة الفلسطينية.
- ثم طرد يستنشق محتوى الخلية في أنبوب 0.2 مل PCR عن طريق كسر غيض ماصة وضغط الصغيرة إيجابية. تجمع محتوى واحد في الخلية PCR أنبوب واحد. بعد الموافقة على محتوى الخلية ، وأنبوب جمع PCR ، قبل تبريده على الجليد ، ويوضع في الفريزر فورا -20 درجة مئوية.
- لاستبعاد احتمال حدوث تلوث من الحطام خارج الخلية التي قد تحتوي على mRNAs ، يتم تخفيض ماصة التصحيح في الأنسجة دون الشفط فعلا السيتوبلازم ثم تتعرض لمحتوى ماصة RT - PCR.
4. عكس النسخ (RT)
- بعد جمع المحتوى الخلية من عدد معقول من الخلايا العصبية ، وعادة 10-20 ، وينبغي أن تبدأ على الفور RT للحد من تدهور mRNAs.
- منذ كمية من محتويات الخلية من خلية عصبية واحدة صغيرة جدا ، لم يتم تنفيذ الإجراء RNA العزلة. لإزالة احتمال تلويث الحمض النووي الجيني ، يتم هضمها أولا محتوى الخلية التي يستنشق أنا الدناز (5 ميكرولتر الدناز الأول و 1.6 ميكرولتر الدناز الاحتياطي الأول ، 5 دقائق عند 25 درجة مئوية). ثم الدناز هو المعطل الأول بإضافة 1.2 ميكرولتر 25 ملم EDTA ويحتضنها في 75 درجة مئوية لمدة 5 دقائق.
- يتم تصنيعه باستخدام الثالث [كدنا] مرتفع عكس المنتسخة المستندة إلى الخلايا مباشرة عدة التجميعي [كدنا] (Invitrogen ، الجدول 1). ويتم تصنيع حبلا الأول [كدنا] في 50 درجة مئوية لمدة 50 دقيقة ، ثم يتم المعطل رد فعل من قبل الحضانة في 85 درجة مئوية لمدة 5 دقائق و 1 ميكرولتر H ريبونوكلياز الإضافةإد لهضم مرنا (37 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة). يتم تخزين [كدنا] واحد الذين تقطعت بهم السبل عند -20 درجة مئوية لمدة PCR التضخيم في وقت لاحق.
- يتم التحقق من إزالة كاملة من الحمض النووي الجينومي بواسطة RT - ناقص التحكم التي يتم فيها حذف الناسخ العكسي في حين أن جميع المكونات الأخرى كانت ردة فعل نفس الشيء بالضبط.
5. PCR التضخيم اثنين من المرحلة
- وقد صممت أجهزة الاشعال وفقا لتسلسل في بنك الجينات. كلما كان ذلك ممكنا ، واستخدمت إنترون - الممتدة أزواج التمهيدي التي تساعد في الكشف عن التلوث الجيني DNA. يتم سرد تسلسل الزوج التمهيدي في الجدول 2. ينبغي أن تكون فعالية من أزواج التحقق التمهيدي الأول mRNAs الدماغ كله المنتجات التي تدر إيجابية. وقد تم تجميع جميع الاشعال بواسطة تقنيات الحمض النووي المتكاملة (كورالفيل ، أيوا ، الولايات المتحدة).
- في المرحلة الأولى ، يتم تضخيمه 5 ميكرولتر من cDNAs 30 ميكرولتر لمدة 35 دورات في حضور الزوج التمهيدي (الجدول 2). بروتوكول الدراجات الحرارية للcycler الحرارية (MasterCycler ، إيبندورف ، الجدول رقم 1) هو 2 في 94 دقيقة درجة مئوية لتمسخ الأولي ، ثم 35 دورات من 15 ثانية في 94 درجة مئوية إلى تفسد ، 30 ثانية عند درجة حرارة 55 مئوية ليصلب ، و 45 ثانية في 72 درجة مئوية إلى تمديد ، تليها 7 دقائق لتمديد النهائي. طق بوليميريز الحمض النووي ، triphosphates deoxynucleotide (dNTPs) ، وجميع المكونات الأخرى اللازمة لتضخيم PCR يتم توفيرها من قبل مزيج السوبر PCR (Invitrogen ، الجدول 1)
- PCR في المرحلة الثانية ، يتم استخدام المنتج من 1 ميكرولتر من التضخيم ش 1 PCR المرحلة كقالب ويستخدم هذا الزوج التمهيدي نفسها التي استخدمت في المرحلة الأولى (الجدول 2). يتم تشغيل 40 دورة مع تمديد الوقت اختصارها إلى 30 ثانية. يتم استخدام نفس مزيج السوبر PCR.
- تصور يتم فصل المنتجات PCR التضخيم من المرحلة الثانية 2 بنسبة 2.5 ٪ agarose هلام إستشراد ، باستخدام بروميد إيثيديوم (0.05 مل mg/100 الجل) أو gelgreen تحت ضوء الأشعة فوق البنفسجية ، وتصويرها (الشكل B4). الفرق الإيجابي تقطع بعد ذلك ، استخرجت باستخدام استخراج Qiagen طقم (الجدول 1) ، والتسلسل ، وبالمقارنة مع تسلسل نشرها من الجينات المستهدفة.
6. ممثل النتائج :
الدوبامين (DA) الخلايا العصبية في الجزء المكتنزة substantia أسود والجزء الشبكي والخلايا العصبية المجاورة الإسقاط GABA في المادة السوداء الجزء الشبكي لها خصائص متميزة الكهربية (زهو وآخرون 2006 ؛ أقرع وآخرون 2011). كما هو مبين في الشكل. 1B2 ، SNR الخلايا العصبية GABA المعرض عالية التردد التشويك العفوي نحو 10 هرتز. والتموج لديها قاعدة مدة حوالي 1 مللي ثانية. عند حقن hyperpolarizing الحالية ، SNR الخلايا العصبية GABA عرض تبلد depolarizing ضعف استجابة لhyperpolarizing الحقن الحالية ، مما يدل على ضعف التعبير أنا ح الحالية في هذه الخلايا العصبية (الشكل 1B2). في المقابل ، فإن الخلايا العصبية nigral DA المعرض التردد المنخفض (حوالي 2 هرتز) التموج العفوية التي لديها قاعدة مدتها حوالي 3 مللي. DA الخلايا العصبية تظهر أيضا الترهل وضوحا في الاستجابة لحقن hyperpolarizing الحالي ، مما يدل على التعبير القوي أنا ح الحالية (الشكل 1B3) (زهو وآخرون 2006 ؛. دينغ وآخرون 2011).
الكشف عن scRT - PCR مرنا لكربوكسيل حمض الجلوتاميك 1 (GAD1 ، الانزيم الرئيسي لتخليق GABA والخلايا العصبية من أجل تحقيق علامة GABA) في الخلايا العصبية التي تم تحديدها electrophysiologically GABA الأب ، ولكن ليس في الخلايا العصبية DA (الشكل 1B4 ، 5) في المقابل ، كشف scRT - PCR مرنا لهيدروكسيلاز التيروزين (TH ، الانزيم الرئيسي لتخليق الدوبامين وعلامة ألف لالعصبونات DA) في SNC electrophysiologically والخلايا العصبية التي تم تحديدها SNR DA ، ولكن ليس في الخلايا العصبية GABA (الشكل 1B4 ، 5) حتى scRT - PCR النتائج تؤكد على تحديد الخلايا العصبية الكهربية. المقبل ، واستخدمت scRT - PCR لملف تعبير عن الجهد تنشيط مفارز قناة Kv3 ، Kv3.1 ، Kv3.2 ، وKv3.3 Kv3.4. هذه تسهم في تشكيل مفارز الجهد بوابات K + قنوات متنوعة اعتمادا على خصائص التكوين الوحيدات (أقرع وآخرون 2011). في المثال SNR GABA العصبون هو مبين في الشكل. تم الكشف عن 1B4 ، mRNAs للKv3.1 ، Kv3.3 ، وKv3.2 Kv3.4. في المثال SNR DA العصبون هو مبين في Fig.1B5 فقط Kv3.2 Kv3.3 ، وتم الكشف عن Kv3.4. في تجميع البيانات المتوفرة لدينا ، وكان أكثر تكرارا في اكتشاف الخلايا العصبية Kv3.1 GABA SNR من الخلايا العصبية في nigral DA ، مما يشير إلى مستوى أعلى من التعبير Kv3.1 في الخلايا العصبية السريعة التشويك GABA SNR (أقرع وآخرون 2011).
الشكل 1. تحديد الكهربية للخلايا العصبية SNR GABA والخلايا العصبية nigral DA A :.. ويمكن تحديد المناطق التي nigral موقعها التشريحي متميزة A1 يظهر موقع المجلس الوطني الأعلى والأب في القسم نيسل الملطخة الاكليلية مع أسر هدفا 1X. كانت المنطقة محاصر capturالطبعة مع هدف 10X وعرضها في منتصف كما يدل على ذلك السهم. المجلس الوطني الأعلى الخلية الغنية والفقيرة الخلية SNR مرئية بوضوح. A2 يبين موقع المجلس الوطني الأعلى والأب في قسم الأحياء ، غير ملوثين الاكليلية مع أسر هدفا 4X. المجلس الوطني الأعلى الخلية الغنية والفقيرة SNR الخلية هي أيضا محددة بوضوح. VTA أو المنطقة الجوفية السقيفية. B1 يظهر التصحيح SNR عصبون GABA التي فرضت في خلية كاملة واسطة. B2 يبين الخصائص النموذجية الكهربية للخلايا العصبية في GABA SNR الحالية المشبك وضع التسجيل. هذه الخلايا العصبية النار عفوية العمل الترددات العالية المحتملة لمدة قصيرة ولها استجابة ضعيفة أنا تبلد ح بوساطة لhyperpolarizing الحقن الحالية. B3 يبين الخصائص الكهربية للخلايا العصبية نموذجية DA nigral الحالية في وضع المشبك التسجيل. يطلقون عفوية العمل التردد المنخفض الإمكانات لمدة طويلة وأنا وأحد أبرز ح بوساطة تبلد (رئيس السهم) ردا على hyperpolarizing الحقن الحالية. وهكذا ، يتم تحديدها بوضوح SNR GABA الخلايا العصبية والخلايا العصبية الدوبامين nigral electrophysiologically. B4 يظهر صورة هلام من scRT - PCR المنتجات الكهربية من تحديد الخلايا العصبية GABA SNR. تم الكشف عن كربوكسيل الغلوتامات 1 (GAD1) مرنا ولكن لا هيدروكسيلاز التيروزين (TH) مرنا. تم الكشف عن mRNAs Kv3.1 ، Kv3.3 ، وKv3.2 Kv3.4 في هذه الخلايا العصبية GABA SNR. B5 يظهر scRT - PCR الكشف عن الخلايا العصبية mRNAs قناة Kv3 في الخلايا العصبية DA SNR. تم الكشف عن TH مرنا ولكن لا GAD1 مرنا في الخلايا العصبية التي تم تحديدها electrophysiologically DA SNR. تم الكشف عن mRNAs Kv3.3 ، وKv3.2 Kv3.4 في هذا B6 SNR الخلايا العصبية. DA تظهر البيانات المجمعة.
7. النتائج الإيجابية المحتملة كاذبة وزائفة سلبية
بناء على تجربتنا ، ويمكن لعوامل عدة تؤدي إلى نتائج خاطئة scRT - PCR سلبية. وتشمل هذه العوامل فشل في الشفط كمية كافية من السيتوبلازم بسبب انسداد تلميح التصحيح ماصة ، وتلوث ريبونوكلياز ، وعدم كفاءة الاشعال PCR. التصحيح انسداد تلميح ماصة عادة ما يمكن رؤيتها على شاشة فيديو وأشارت إلى زيادة فرص الوصول من خلال المقاومة. ويمكن تجنب التلوث ريبونوكلياز التعطيل شامل وارتداء القفازات. وينبغي اختبار PCR فعالية التمهيدي باستخدام الحمض النووي الريبي مجموع من الدماغ لكمة النسيج (زهو وآخرون 2008 ؛. دينغ وآخرون 2011).
لأننا دائما استخدام الدناز لعلاج اول عينات لدينا قبل RT ، ولم نواجه نتائج إيجابية كاذبة. نظريا ، من دون هضم الدناز ، التلوث الجيني ، وبالتالي الكشف عن الحمض النووي ايجابية كاذبة قد تحدث عندما تكون الجينة intronless أو الزوج التمهيدي لا تمتد هذه المنطقة إنترون.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
مزيج من تسجيل المشبك التصحيح في الدماغ مع شريحة scRT - PCR أظهرت نقدم هنا وسيلة ممتازة للتحقيق في ملامح التعبير مرنا للقنوات ايون ، والمستقبلات ، والإنزيمات الرئيسية لتخليق الموصلات العصبية في الخلايا العصبية تتميز بشكل فردي. هذا مفيد بشكل خاص عندما لا يمكن للبروتين في السؤال يتم الكشف عن والمترجمة باستخدام وسائل أخرى مثل المناعية نتيجة لانخفاض مستوى التعبير و / أو عدم وجود الأجسام المضادة المناسبة (Surmeier وآخرون 1996 ؛. زهو وآخرون 2009). حساسية عالية والانتقائية في السماح scRT - PCR في الكشف عن وفرة mRNAs منخفضة (Surmeier وآخرون 1996). بالإضافة إلى ذلك ، هذا الأسلوب يسمح للارتباط في التعبير الجيني مع الخصائص الكهربية وظيفية في الخلايا العصبية تتميز بشكل فردي (هيك وآخرون 2001 ؛. زهو وآخرون 2008 ، 2009 ؛. دينغ وآخرون 2011). بناء على أدلة والأدب وخبرتنا ، وهذه الطريقة تنطبق على كل أنواع الخلايا العصبية في الجهاز العصبي.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الإعلان عن أي تضارب في المصالح.
Acknowledgments
وأيد هذا العمل عن طريق المنح والمعاهد الوطنية للصحة R01DA021194 R01NS058850.
Materials
|
|||
|
Table 1. Key reagents and equipment
Table 2. Primer pairs for rat neuronal Kv3 channel, tyrosine hydroxylase (TH) and glutamic acid decarboxylase 1 (GAD1) mRNAs for scRT-PCRReferences
- J, Tuning pacemaker frequency of individual dopaminergic neurons by Kv4.3L and Kchip3.1 transcription. EMBO J. 20, 5715-5724 (2001).
- Surmeier, D. J., Song, W. J., Yan, Z. Coordinated expression of dopamine receptors in neostriatal medium spiny neurons. J. Neurosci. 16, 6579-6591 (1996).
- Zhou, F. W., Matta, S. G., Zhou, F. -M. Constitutively active TRPC3 channels regulate basal ganglia output neurons. J. Neurosci. 28, 473-482 (2008).
- Zhou, F. W., Jin, Y., Matta, S. G., Xu, M., Zhou, F. -M. An ultra-short dopamine pathway regulates basal ganglia output neurons. J. Neurosci. 29, 10424-10435 (2009).
- Ding, S., Matta, S. G., Zhou, F. -M. Kv3-like potassium channels are required for sustained high-frequency firing in Basal Ganglia output neurons. J. Neurophysiol. 105, 554-570 (2011).
- Zhou, F. W., Xu, J. J., Zhao, Y., Ledoux, M. S., Zhou, F. -M. Opposite functions of histamine H1 and H2 receptors and H3 receptors in substantia nigra pars reticulata. J. Neurophysiol. 96, 1581-1591 (2006).
