Профилирование напряжения закрытого калия Выражение мРНК канала в Nigral Нейроны использованием Одноклеточный-ПЦР методов

Summary

Нейроны первого характеризуется электрофизиологически. Затем из цитоплазмы записаны нейрона всасывается и подвергается обратной транскрипции-ПЦР-анализ для выявления экспрессии мРНК для синтеза нейромедиаторов ферменты, ионные каналы, и рецепторы.

Abstract

В млекопитающих центральной нервной системы, различных типов нейронов с различными молекулярными и функциональными характеристиками перемешаны друг с другом, трудно разделить, а также не так легко определить по их морфологии. Таким образом, часто бывает трудно проанализировать экспрессию генов в определенный тип нейронов. Здесь мы документе процедура, которая сочетает в себе целых клеток патч методы зажима записи с одноклеточных обратной транскрипции полимеразной цепной реакции (ПЦР-scRT) на профиль экспрессии мРНК в различных типах нейронов в существенной черная. Электрофизиологические методы впервые использована для записи нейрофизиологические и функциональные свойства отдельных нейронов. Затем, цитоплазме одной электрофизиологически характеризуется nigral нейронов всасывается и подвергается scRT-ПЦР-анализ для получения профилей экспрессии мРНК для синтеза нейромедиаторов ферментов, рецепторов и ионных каналов. Высокая селективность и чувствительность делают этот метод особенно полезен при иммуногистохимии не может быть использована из-за отсутствия подходящих антител или низкий уровень экспрессии белка. Этот метод также применим для нейронов в других областях мозга.

Protocol

1. Подготовка мозга срез

1. Молодые (15-40 дней) мужского и женского Sprague-Dawley крыс используются. (Мы также используем эту же протокол на мышах.) При глубокой анестезии уретана, животных обезглавливали и мозг быстро расчлененное из. Затем 300 мкм толщиной корональных ломтики мозга, содержащего midrostral части черной субстанции разрезаются на Leica vibratome (VT-1200S). Ломтик резки процедура выполняется в ледяной, кислородом высокой сахарозы резки раствора, содержащего (в мм): 220 сахарозы, 2,5 KCl, 1,25 NaH _{2 4} PO, 25 ₃ NaHCO, 0,5 ₂ CaCl, 7 MgCl _2, 10 Д- глюкозы. Это пузырилась смесью 95% O ₂ / 5% CO ₂ держать кислородом и поддерживать рН на уровне 7,4. Держите резки решение ледяной течение всей процедуры.
2. Мозг срезы инкубировали в инкубационный камере, наполненной кислородом искусственной цереброспинальной жидкости (aCSF), содержащий (в мм): 125 NaCl, 2,5 KCl, 1,25 NaH _{2 4} PO, 25 ₃ NaHCO, 2,5 ₂ CaCl, MgCl 1,3 _2, 10 D-глюкозы. Это пузырилась смесью 95% O ₂ / 5% CO ₂ держать кислородом и поддерживать рН на уровне 7,4. Инкубационный температуре 34 ° С в течение 45 мин, а затем при комнатной температуре до мозга срез переносится на записи камеры.

2. Электрофизиологические дактилоскопию nigral нейронов

1. Один срез мозга передается в записи патча зажим камеры непрерывно озарен кислородом aCSF на 32 ° C.
2. Патч пипетки вытащил из автоклавного боросиликатного (KG-33) стеклянная капиллярная трубка (1,10 мм идентификатор, 1,65 мм диаметр, король Precision Стекло, Клермонт, штат Калифорния) с помощью ПК-10 съемник (Narishige, Токио, Япония) и наполнен внутриклеточных решение подготовлен с ДНКазы-РНКазы без воды (Fisher Scientific) (содержащей 135 мМ KCl, 0,5 мМ EGTA, 10 мМ HEPES, 1,5 мМ MgCl _2, рН до 7,3). Патч пипетки имеют сопротивление 2-3 МОм в ванне.
3. Черной субстанции определяется в соответствии с его расположение различных анатомических (рис. 1А1-2). Под визуальным руководством видео микроскоп (Olympus BX51W1), оснащенных Номарского оптики и объектив 60X погружением в воду, большие клетки черной субстанции Парс компактов (SNC) и черной субстанции Парс геисиЫа (SNR) (возможно нейронов DA и ГАМК нейронов) выбираются для записи. Обычные гига-ом герметичное уплотнение цельноклеточная конфигурация получена (рис. 1B1). Текущий зажим зажим и напряжения анализы могут быть выполнены. Чтобы свести к минимуму деградации мРНК, электрофизиологические записи должно быть кратким (≤ 5 мин). Один из вариантов заключается в записи только мембраны и пики свойства обеспечить электрофизиологических отпечатков пальцев для нейронов интересов (рис. В2-3). Эта краткая запись занимает всего около 1 мин.

3. Цитоплазма стремление

1. После снятия отпечатков пальцев и электрофизиологических характеристик SNR ГАМК и Д. А. нейронов, нежный рот всасывающий применяется для аспирации цитоплазме. Клеточное ядро ​​также может быть атмосферный, в результате загрязнения геномной ДНК. Герметичное уплотнение не должна быть нарушена, в противном случае внеклеточного мусора, включая мРНК может быть втянутыми в патч пипетки и загрязнять содержимого ячейки. Целостность герметичное уплотнение хорошо до тех пор, как увеличение тока удержания при -70 мВ, не превышает 100 мкА.
2. Затем атмосферный содержимого ячейки выталкивается в трубку 0,2 мл ПЦР, разбив кончиком пипетки и малого положительного давления. Один содержание ячейки собираются в одно ПЦР-пробирку. После принятия содержимого ячейки, сбор ПЦР трубку, предварительно охлажденные на льду, сразу же помещают в морозильник -20 ° C.
3. Чтобы исключить загрязнение внеклеточного мусора, который может содержать мРНК, патч пипетки опускают в ткани, фактически не аспирационных цитоплазме, а затем содержимое пипетки подвергается RT-PCR.

4. Обратной транскрипции (RT)

1. После сбора содержимого ячейки с разумным количеством нейронов, как правило, 10-20, РТ должна начаться немедленно, чтобы свести к минимуму деградации мРНК.
2. Так как количество содержимого ячейки от одного нейрона слишком мал, РНК изоляции процедура не выполняется. Чтобы удалить потенциального загрязнения геномной ДНК, атмосферный содержание ячейки первого усваивается ДНКазы I (5 мкл ДНКазы I и 1,6 мкл ДНКазы я буфера, 5 мин при 25 ° С). Затем я ДНКазы инактивируется путем добавления 1,2 мкл 25 мМ ЭДТА и инкубации при температуре 75 ° С в течение 5 мин.
3. кДНК синтезированы с использованием Надстрочный III обратной транскриптазы основе Клетки-Директ кДНК комплект Синтез (Invitrogen, таблица 1). Первую цепь кДНК синтезировали при 50 ° С в течение 50 минут, то реакция инактивируется инкубации при температуре 85 ° С в течение 5 мин и 1 мкл РНКазы Н, это добавитьред переварить мРНК (37 ° С в течение 20 мин). Одноцепочечной кДНК хранится при температуре -20 ° C для последующего ПЦР-амплификации.
4. Полное удаление геномной ДНК проверяется RT-минус контролем, в которых обратной транскриптазы опущена в то время как все остальные компоненты реакции были точно такими же.

5. Два этапа ПЦР-амплификации

1. Праймеры были разработаны в соответствии с последовательностей в GenBank. Когда это возможно, интрон-охватывающей пар праймеров были использованы, которые помогают определить геномный загрязнения ДНК. Последовательности пары праймеров приведены в таблице 2. Эффективность пар праймеров должна быть первой проверяется весь мРНК мозга, которые дают положительные продукции. Все праймеры синтезированы Комплексная ДНК технологий (Coralville, штат Айова, США).
2. На первом этапе, 5 мкл 30 мкл кДНК усиливается в течение 35 циклов в присутствии пары праймеров (табл. 2). Тепловой протокол круговорот термоциклер (Mastercycler, Эппендорф, таблица 1), 2 мин при 94 ° С в течение начальной денатурации, затем 35 циклов 15 с при 94 ° С для денатурации, 30 с при 55 ° C для отжига, и 45 с при 72 ° C расширить, а затем 7 минут для окончательного расширение. Taq ДНК-полимеразы, дезоксинуклеотидов трифосфатов (дНТФ), и все другие компоненты, необходимые для ПЦР-амплификации предоставляются ПЦР супер микс (Invitrogen, таблица 1)
3. На втором этапе ПЦР, продукт 1 мкл с ^1-го этапа усиления ПЦР используется в качестве шаблона и той же пары праймеров, используемых в первом этапе используется (табл. 2). 40 циклов, выполняются с расширением время сокращается до 30 секунд ПЦР супер же смесь используется.
4. ПЦР-продукты от ^2-й этап усиления разделены на 2,5% агарозном гель-электрофореза, визуализируется этидия бромид (0,05 мг/100 мл геля) или gelgreen под УФ-светом, и сфотографировали (рис. В4). Положительных полос затем вырезать, извлекали с помощью комплекта Qiagen добычи (табл. 1) и последовательность, а по сравнению с опубликованными последовательностями генов-мишеней.

6. Представитель результаты:

Дофамин (ДА) нейронов черной субстанции Парс компактов и Парс геисиЫа и соседних нейронов ГАМК проекции в черной субстанции Парс геисиЫа имеют различные электрофизиологических характеристик (Zhou и др. 2006;. Дин и др. 2011 год.). Как показано на рис. 1B2, SNR ГАМК нейроны обладают высокой частотой спонтанного пики около 10 Гц. Шипы имеют базовое время около 1 мс. По гиперполяризующих инжекции тока, SNR ГАМК нейронов дисплей слабый деполяризующего провисают в ответ на гиперполяризующих инжекции тока, что указывает на слабое выражение я _ч ток в этих нейронов (рис. 1В2). В отличие от нейронов nigral Д. проявляют низкую частоту (около 2 Гц) спонтанная шипы, которые базовое время около 3 мс. DA нейроны также показывают выраженный провисают в ответ на гиперполяризующих инжекции тока, что указывает на сильное выражение я _ч тока (рис. 1B3) (Zhou и др. 2006;.. Дин и др., 2011).

scRT-ПЦР обнаружена мРНК глутаминовой кислоты декарбоксилазы 1 (GAD1, ключевой фермент для синтеза GABA и маркер нейронов ГАМК) в электрофизиологически определены SNR ГАМК нейронов, но не в DA нейронов (1B4 рис. 5). В противоположность этому, scRT-ПЦР обнаружены мРНК тирозингидроксилазы (TH, ключевого фермента для синтез дофамина и маркер нейронов DA) в электрофизиологически определены SNC и SNR DA нейроны, но не в ГАМК-нейроны (1B4 рис. 5). Так scRT-PCR результаты подтверждают электрофизиологические идентификации нейрона. Далее, scRT-PCR была использована для профиля выражение напряжения активированных KV3 канал подразделения, Kv3.1, Kv3.2, Kv3.3 и Kv3.4. Эти подразделения вклад в форме напряжения закрытого K ⁺ каналов различных свойств в зависимости от состава подразделения (Дин и соавт. 2011). В примере, SNR ГАМК нейронов показано на рис. 1B4, мРНК Kv3.1, Kv3.2, Kv3.3 и Kv3.4 обнаружено не было. В примере, SNR Д. нейрона показана на Fig.1B5, только Kv3.2, Kv3.3 и Kv3.4 обнаружено не было. В нашем объединенных данных, Kv3.1 был более часто обнаруживаемых в SNR нейронов ГАМК, чем в nigral DA нейронов, показывая высший уровень экспрессии Kv3.1 в быстро пики SNR ГАМК нейронов (Дин и соавт. 2011).

Рисунок 1. Электрофизиологические идентификации SNR ГАМК нейронов и нейронов nigral Д.А.:.. Nigral области могут быть определены их расположение различных анатомических A1 показано расположение SNC и SNR в корональных Нисслю окрашенных разделе захвачены с 1X цели. Коробках район был CAPTURред с 10X цели и отображается в середине, как показано стрелкой. Клетка богатых SNC и клеточно-бедные SNR четко видны. A2 показано расположение SNC и SNR в живых, неокрашенные корональных разделе захвачены с 4X цели. Клетка богатых SNC и клеточно-бедные SNR также четко идентифицировать. VTA, вентральной области покрышки. B1 показывает SNR ГАМК нейронов будучи патч зажатый в цельноклеточной режиме. В2 показаны типичные электрофизиологических свойств нейронов SNR ГАМК в текущем режиме записи зажима. Эти нейроны пожара спонтанного высокий потенциал действия частоте короткой продолжительности и имеют слабое Я _{ч-опосредованной} провисать ответ на гиперполяризующих инжекции тока. B3 показаны типичные электрофизиологических свойств нейронов nigral DA в текущем режиме записи зажима. Они огонь спонтанного низкой частоты потенциалов действия был продолжительным и играют заметную я _{ч-опосредованной} провисать (стрелки) при ответе на гиперполяризующих инжекции тока. Таким образом, SNR ГАМК нейронов и нейронов допамина nigral четко определены электрофизиологически. B4 показывает гель картину scRT-PCR продуктов из электрофизиологических определены SNR ГАМК нейрона. Глутамат декарбоксилазы 1 (GAD1) ​​мРНК, но не тирозин гидроксилазы (TH) мРНК обнаружено не было. мРНК Kv3.1, Kv3.2, Kv3.3 и Kv3.4 были обнаружены в этом SNR ГАМК нейрона. B5 показывает scRT-ПЦР нейронных каналов мРНК KV3 в SNR Д. нейрона. МРНК TH, но не мРНК GAD1 был обнаружен в электрофизиологически определены SNR Д. нейрона. мРНК Kv3.2, Kv3.3 и Kv3.4 были обнаружены в этом SNR Д. нейрона. B6 показывает, объединенных данных.

7. Потенциальные ложноотрицательных и ложноположительных результатов

Основываясь на нашем опыте, ряд факторов может привести к ложным отрицательным scRT-PCR результаты. Эти факторы включают в себя отказ в аспирационных достаточное количество цитоплазмы из-за патч пипетки засорения, загрязнения РНКазы, и неэффективные праймеров ПЦР. Патч пипетки засорения обычно можно увидеть на видеомонитор и указал на расширение доступа сопротивления. РНКазы загрязнения можно избежать, если тщательно дезактивации и в перчатках. ПЦР праймера эффективности должны быть проверены с помощью тотальной РНК из тканей головного мозга удар (Zhou и др. 2008;.. Дин и др. 2011).

Так как мы всегда используем ДНКазы сначала лечить наших образцов до RT, мы еще не сталкивались ложные положительные результаты. Теоретически, без пищеварение ДНКазы, геномной ДНК загрязнения и тем самым ложное срабатывание обнаружения может возникнуть, когда ген intronless или пары праймеров не охватывает области интрона.

Discussion

Сочетание патч зажим записи в мозг с ломтиком scRT-PCR мы продемонстрировали здесь обеспечивают превосходный метод для исследования профилей экспрессии мРНК для ионные каналы, рецепторы, и ключевые ферменты для синтеза нейротрансмиттеров в индивидуальном характеризуется нейронов. Это особенно полезно, когда белка в вопросе не может быть обнаружен и локализован с помощью других методов, таких как иммуногистохимия из-за низкого уровня экспрессии и / или отсутствия подходящих антител (Surmeier и др., 1996;.. Чжоу и др., 2009). Высокая чувствительность и селективность scRT-PCR позволяют обнаружения мРНК низкой численности (Surmeier и соавт. 1996). Кроме того, этот метод позволяет корреляции экспрессии генов с электрофизиологических и функциональных свойств в индивидуальном характеризуется нейронов (Лисс и др., 2001;. Чжоу и др., 2008, 2009;. Дин и др., 2011 год.). На основании доказательств литературы и наш опыт, этот метод применим к каждому нейрону типов нервной системы.

Materials

Table 1. Key reagents and equipment

Table 2. Primer pairs for rat neuronal Kv3 channel, tyrosine hydroxylase (TH) and glutamic acid decarboxylase 1 (GAD1) mRNAs for scRT-PCR