Summary
Nós descrevemos um método eficiente para separar single-stranded DNA, dupla fita de DNA e RNA de moléculas ambientais comunidades viral. Os ácidos nucleicos são fracionados por cromatografia em fase de hidroxiapatita com concentrações crescentes de fosfato contendo buffers. Este método permite o isolamento de todos os tipos de ácido nucléico viral a partir de amostras ambientais.
Abstract
Vírus, especialmente os bacteriófagos (fagos), são as entidades mais numerosas biológica em 1,2 Terra. Vírus da célula hospedeira modular a abundância e diversidade, contribuem para a ciclagem de nutrientes, alterar anfitrião fenótipo celular, e influenciar a evolução de ambas as células do hospedeiro e as comunidades viral através da transferência lateral de genes 3. Numerosos estudos têm destacado a diversidade genética impressionante de vírus e seu potencial funcional em uma variedade de ambientes naturais.
Metagenomic técnicas têm sido usadas para estudar a diversidade taxonômica e potencial funcional do complexo assemblages viral cujos membros contêm DNA de fita simples (ssDNA), double-stranded DNA (dsDNA) e genótipos RNA 4-9. Protocolos biblioteca atual de construção usado para estudo de DNA contendo ambientais ou RNA contendo vírus requerem um tratamento nuclease inicial, a fim de remover os modelos não-alvo 10. No entanto, uma compreensão abrangente do complemento gene coletiva da comunidade vírus e diversidade de vírus requer o conhecimento de todos os membros, independentemente da composição do genoma. Fracionamento de ácido nucléico purificadas subtipos fornece um mecanismo eficaz pelo qual o estudo assemblages viral sem sacrificar um subconjunto de assinatura genética da comunidade.
Hidroxiapatita, uma forma cristalina de fosfato de cálcio, tem sido empregada na separação de ácidos nucléicos, bem como proteínas e micróbios, desde os anos 1960 11. Ao explorar a interação entre o Ca carga com carga positiva 2 + íons da hidroxiapatita e da espinha dorsal de fosfato carregados negativamente dos subtipos de ácido nucléico, é possível eluir preferencialmente cada subtipo de ácido nucléico independente dos outros. Recentemente, esta estratégia empregada de forma independente fracionar os genomas de ssDNA, dsDNA e RNA-vírus que contenham em preparação de seqüenciamento de DNA 12. Aqui, apresentamos um método para o fracionamento e recuperação de ácidos viral ssDNA, dsDNA e RNA nucleico de misturado assemblages viral utilizando cromatografia de hidroxiapatita.
Protocol
1. Preparação de soluções
Antes de realizar a cromatografia de hidroxiapatita, fosfato de buffers deve ser preparado e da hidroxiapatita deve ser adequadamente hidratado.
- Solução fosfato 1M, pH 6.8: Em um frasco 1L dissolver 119.98g de fosfato de sódio monobásico em 1L de estéril, DEPC tratados com H 2 O. Prepare uma solução de fosfato de sódio 1M dibásico em um frasco 1L, dissolvendo 141.96g de fosfato de sódio dibásico em 1L de estéril, DEPC tratados com H 2 O. Combine o mono-e di-soluções na proporção de 1:1. Frasco lugar em uma placa mexa e misture usando uma barra de agitação magnética. Ajustar o pH para 6,8 pela adição de hidróxido de sódio (para aumentar o pH) ou ácido fosfórico (para diminuir o pH).
- Tampão fosfato 0.12M: Em um frasco de 500ml, combine 30ml de solução de fosfato 1M, pH 6,8, 2,5 ml de 10% de sódio dodecil sulfato (SDS), e 5 ml de EDTA 0.5M. Adicionar estéreis, tratados com DEPC H2O para um volume de 225ml. Ajustar o pH para 6,8. Adicionar estéreis, tratados com DEPC H2O a 250ml. Autoclave.
- Tampão fosfato 0.18M: Em um frasco de 500ml, combine 45ml de solução de fosfato 1M, pH 6,8, 2,5 ml de 10% de sódio dodecil sulfato (SDS), e 5 ml de EDTA 0.5M. Adicionar estéril, DEPC tratados com H 2 O para um volume de 225ml. Ajustar o pH para 6,8. Adicionar estéril, DEPC tratados com H 2 O para 250ml. Autoclave.
- Tampão fosfato 0,20 m: Em um frasco de 500ml, combine 50ml de solução de fosfato 1M, pH 6,8, 2,5 ml de 10% de sódio dodecil sulfato (SDS), e 5 ml de EDTA 0.5M. Adicionar estéril, DEPC tratados com H 2 O para um volume de 225ml. Ajustar o pH para 6,8. Adicionar estéril, DEPC tratados com H 2 O para 250ml. Autoclave.
- Tampão fosfato 0,40 M: num frasco de 500ml, 100ml de combinar solução de fosfato 1M, pH 6,8, 2,5 ml de 10% de sódio dodecil sulfato (SDS), e 5 ml de EDTA 0.5M. Adicionar estéril, DEPC tratados com H 2 O para um volume de 225ml. Ajustar o pH para 6,8. Adicionar estéril, DEPC tratados com H 2 O para 250ml. Autoclave.
- "O fosfato 1.00M Buffer" (concentração real de fosfato nesta solução é 0,91 M): Em um frasco de 500ml, combine 30ml de solução de fosfato 1M, pH6.8, 2,5 ml de 10% de sódio dodecil sulfato (SDS), e 5 ml de 0,5 M EDTA. Adicionar estéreis, tratados com DEPC H2O para um volume de 225ml. Ajustar o pH para 6,8. Adicionar estéril, DEPC tratados com H 2 O para 250ml. Autoclave.
- Hidratação hidroxiapatita: Peso fora 1g de hidroxiapatita e adicionar a um tubo de 50ml. Adicionar 6ml de tampão fosfato 0.12M à hidroxiapatita e inverta para misturar. Antes do uso trazer temperatura para 60 ° C e misture bem. Armazenar por longos períodos de tempo a 4 ° C.
- Antes do uso, equilibram todos os tampões fosfato e hidroxiapatita hidratado a 60 ° C.
2. Preparação de Econo-Column
- Fechar torneira. Enxaguar várias vezes a coluna com H 2 O deionizada por várias vezes invertendo a coluna e decantação.
- Retire a torneira da coluna e Econo autoclave para esterilizar a coluna.
- Substituir e fechar torneira. Adicionar 1 ml de Sigmacote ao estéril Econo-coluna e casaco todas as superfícies de vidro. Abra a torneira e decantar.
- Anexar coluna para um banho de água circulante e ajustar a temperatura a 60 ° C. Para einsure o mínimo de perda de calor através da coluna envolvendo a coluna em um agente isolante, tais como folha de alumínio ou isolamento de tubos de espuma é recomendado.
- Lavar a Econo-coluna duas vezes com estéril, livre de RNase H 2 O, em seguida, duas vezes com estéril, tampão fosfato 0.12M RNase.
3. Cromatografia Hydroxypaptite
- Certificando-se a torneira está fechada, lentamente, adicione 2 ml de pré-preparada de hidroxiapatita, em suspensão para o fundo da Econo-coluna usando uma pipeta estéril de 2ml sorológicos.
- Permitir que a hidroxiapatita para resolver sob a força de gravidade por 30 minutos.
- Dreno tampão de coluna e torneira perto. Combine ácidos nucléicos com tampão fosfato 0.12M em um volume final de 500 mL e incubar a 60 ° C por 10 minutos em um bloco de aquecimento ou banho-maria.
- Aplicar rapidamente ácidos nucléicos preparadas em tampão fosfato 0.12M à hidroxiapatita, utilizando uma pipeta 2ml sorológicos tomando cuidado para não perturbar a coluna.
- Permitir que os ácidos nucléicos de se ligar à hidroxiapatita por 30 minutos.
- Coloque um tubo de 15ml na coluna, abra a torneira e coletar a amostra inicial contendo ssDNA. Fechar torneira.
- Adicionar 6ml de tampão fosfato 0.12M à hidroxiapatita tomando cuidado para não perturbar a coluna, abrir a torneira, e recolher single-stranded DNA no tubo de 15ml da etapa anterior. Fechar torneira.
- Adicionar um volume de um fenol: clorofórmio: álcool isoamílico (25:25:1 v / v / v) solução para o tubo, misturar vigorosamente e centrifugar a 3500 xg por 15 minutos. Transferência de ssDNA contendo sobrenadante para um novo tubo 15ml.
- Repita 3,76 e 3,87 usando 6ml de tampão fosfato 0,20 m e paraalaúde e purificar RNA a partir da coluna certificando-se de usar um novo tubo para a coleta de 15ml.
- Repita 3,76 e 3,87 usando 6ml de tampão fosfato 0,40 m para eluir e purificar dsDNA da coluna certificando-se de usar um novo tubo para a coleta de 15ml.
- Repita 3,76 e 3,87 usando 6ml de tampão fosfato 1.00M para tirar a coluna de qualquer dsDNA residual certificando-se de usar um novo tubo para a coleta de 15ml.
4. Dessalinização Amostras de Ácido Nucleico
- Transferência de 4-5ml de amostra para um Amicon Ultra-4 dispositivo centrífugo filtro equipado com um peso molecular 30.000 cortado membrana Ultracel.
- Concentre-se amostra para <500μl girando a 6.000 xg, 30 ° C, a 5 minutos (ou até que seja alcançado volume concentrado) em um rotor de ângulo fixo. Descartar fluir.
- Adicione o restante da amostra (s) para o Ultra-4 Amicon dispositivo centrífugo filtro e colocar o volume até 4-5ml com RNAse tampão TE 1X.
- Concentre-se amostra para <500μl girando a 6.000 xg, 30 ° C, a 5 minutos (ou até que seja alcançado volume concentrado) em um rotor de ângulo fixo. Descartar fluir.
- Adicione 4-5ml de tampão TE Rnase livre 1X ao Ultra-4 Amicon dispositivo centrífugo filtro. Concentre-se amostra para <500μl por centrifugação a 6.000 xg, 30 ° C, a 5 minutos (ou até que seja alcançado volume concentrado) em um rotor de ângulo fixo. Descartar fluir.
- Repita o passo 4,5 um adicional de 5 vezes para dessalinizar amostra de ácido nucleico (s).
- Transferência de amostra restante (s) para um tubo eppendorf estéril 1.7ml. Adicionar 1/10th volume de acetato de sódio 3M, pH 7.0, dois volumes de etanol 100%, e 1μl de Glycoblue. Misture bem em vórtice.
- Centrifugar a 28.000 xg, 4 ° C, 60 minutos. Decantar tomando cuidado para não perturbar o sedimento. Adicionar 300 ul de etanol 70%. Giram a 28.000 xg temperatura ambiente, por 10 minutos. Decantar, seco e ressuspender cada fração em um volume adequado de RNase tampão TE.
5. Resultados representativos:
A Figura 1 resume os métodos apresentados para a utilização de cromatografia de hidroxiapatita para fracionar ssDNA, dsDNA e ácidos nucléicos RNA a partir de um assemblage mista viral. Este método explora a interação carga entre a espinha dorsal de fosfato carregados negativamente dos ácidos nucléicos e Ca 2 + positivamente carregada íons presentes na hidroxiapatita e permite o fracionamento eficiente dos subtipos de ácido nucléico (ssDNA, dsDNA e RNA) com concentrações crescentes de fosfato tampão 12.
O fracionamento de hidroxiapatita de uma in vitro "comunidade" de ssDNA conhecidos (M13mp18), dsDNA (lambda) e RNA (MS2 e phi6) genomas virais é ilustrada na Figura 2. Os ácidos nucléicos foram combinados em concentrações iguais, aplicada à coluna de hidroxiapatita e foram eluídos com uma crescente concentração de tampão fosfato. Cada subtipo de ácido nucléico elui independente das outras, com menos de 9% carry-over de uma fração para o próximo.
A aplicação desta técnica para ácidos nucléicos isolados de uma comunidade viral coletado da Baía de Chesapeake é mostrado na Figura 3. A produção total de ácidos nucléicos isolados do vírus purificado foi aplicada à coluna de hidroxiapatita. Material genético consiste de ssDNA, RNA e dsDNA foi independentemente eluída com 0.12M, 0,20 m e concentrações 0.40M/1.00M de tampão fosfato, respectivamente. Double-stranded DNA é eluído em concentrações de fosfato de 0,40 m e 1.00M e, neste caso, domina esta comunidade viral em comparação com genótipos ssDNA e RNA. Esta observação é consistente com a composição da comunidade esperado viral de ambientes marinhos e estuarinos onde a maioria dos ácidos nucléicos são recuperáveis dsDNA 13.
Figura Diagrama 1. Do método de cromatografia de hidroxiapatita para o fracionamento de ácidos nucléicos. Uma mistura de ssDNA, dsDNA e RNA preparadas em tampão fosfato 0.12M é aquecida a 60 ° C e aplicada a uma coluna de hidroxiapatita mantida a 60 ° C constante através de um banho de água circulante. Ácidos nucléicos (ssDNA, RNA e dsDNA) são eluída da hidroxiapatita com concentrações crescentes de um tampão de fosfato contendo. Esta figura foi reproduzido com permissão da Sociedade Americana de Microbiologia e foi originalmente apresentado em al-Andrews et Pfannkoch. 2010 12.
Figura 2. Separação de ácidos nucléicos virais conhecidos através de cromatografia de hidroxiapatita. Concentrações iguais de M13mp18 ssDNA, ssRNA MS2, dsRNA phi6 e dsDNA lambda (faixas 2-5, respectivamente) foram combinadas (faixa 6) e aplicado a uma coluna de hidroxiapatita. Single-stranded DNA (M13mp18), RNA (MS2/phi6) e dsDNA (lambda) foram independentemente eluída da coluna de hidroxiapatita utilizando 0.12M (faixa 8), 0.18M (faixa 9) e 0.40M/1.00M (faixa 10) . Uma escada 1kb (faixas 1, 7) foi utilizado para confirmar tamanhos genoma. Esta figura foi reproduzido com permissão da Sociedade Americana de Microbiologia e foi originalmente apresentado em al-Andrews et Pfannkoch. 2010 12.
Figura 3. Separação de ácidos nucléicos virais isoladas de uma comunidade dentro da Baía de Chesapeake. Ácidos nucléicos foram isolados e aplicada a uma coluna de hidroxiapatita. ssDNA (lane 0.12M), RNA (pista 0,20 m) e dsDNA (pistas 0.40M/1.0M) foram independentemente eluída usando concentrações de tampão fosfato 0.12M, 0,20 m e 0.40M/1.00M, respectivamente. Oi Ladder DNA Mass (lane L1) e Ladder 1kb (lane L2) foram usados para confirmar visualmente peso molecular aproximado e massa de ácidos nucléicos. Esta figura foi reproduzido com permissão da Sociedade Americana de Microbiologia e foi originalmente apresentado em al-Andrews et Pfannkoch. 2010 12.
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Discussion
A metodologia de cromatografia de hidroxiapatita apresentado aqui é uma ferramenta altamente eficiente e robusto para o fracionamento de ácidos nucléicos a partir de conjuntos mistos viral, quando o objetivo é estudar a composição de ácidos nucléicos totais da comunidade. Geralmente, ssDNA, RNA e dsDNA vai saem da coluna pho concentrações de fosfato tampão maior que cerca de 0,40 m ~ 0and respectivamente. No entanto, cada preparação de hidroxiapatita pode ter uma composição ligeiramente diferente eo perfil de eluição por isso é importante para testar cada preparação usando conhecida ácidos nucléicos (por exemplo, de uma preparação de vírus cultivados). Isso permitirá que o utilizador para verificar as concentrações específicas de fosfato contendo buffers necessários para eluir os ácidos nucléicos desejado.
Um fator limitante desta técnica é a quantidade de Ca 2 + disponível íons presentes na hidroxiapatita que pode se ligar a espinha dorsal de fosfato dos ácidos nucléicos. O capacityamount da hidroxiapatita na coluna pode ser escalado para cima ou para baixo a coluna (ditada pelo tamanho da jaqueta de água da coluna e quantidade de hidroxiapatita utilizado) eo volume de buffers usados para a eluição pode ser escalado para cima ou para baixo para acomodar muito pequeno ou grandes quantidades de ácidos nucléicos de entrada, mas é basicamente limitado pelo tamanho da coluna de água de jaqueta.
Além disso, uma técnica de lotes onde os ácidos nucléicos, hidroxiapatita e fosfato contendo buffers são combinados em um tubo, misturado, e centrifugação a baixa velocidade é uma forma alternativa de isolar alvo ácidos nucléicos. Esta estratégia pode ser benéfico em alguns casos, mas não é tão confiável quanto os métodos cromatográficos que são mais precisos e fornecer uma melhor fracionamento de ácidos nucléicos.
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Disclosures
Não há conflitos de interesse declarados.
Acknowledgments
Esta pesquisa foi suportada pelo Escritório de Ciência (BER), Departamento de Energia dos EUA, Acordo de Cooperação n º. De-FC02-02ER63453, o Programa Nacional Science Foundation Seqüenciamento do Genoma Microbiana (números 0626826 e 0731916 prêmio). Agradecemos a John de vidro para sua perícia técnica e aconselhamento e Eric K. Wommack por sua ajuda com a coleta de amostras ambientais.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Econo-Column | Bio-Rad | 737-0717 | 0.7cm ID package/2 |
| Hydroxyapatite | Bio-Rad | 130-0520 | DNA Grade Bio-Gel HTP Gel, 100g/td> |
| Sodium Phosphate, Monobasic | VWR international | VW1497-01 | Monohydrate, Crystal 500g |
| Sodium Phosphate, Dibasic | VWR international | VW1496-01 | Anhydrous, Powder 500g |
| DEPC-treated Water | Invitrogen | AM9922 | 1L |
| 10% SDS Solution | Invitrogen | 24730-020 | UltraPure, 1L |
| 0.5M EDTA | Invitrogen | AM9262 | pH 8.0, 1L |
| Sigmacote | Sigma-Aldrich | SL2-25ML | |
| 2ml serological pippette | VWR international | 89130-884 | Polystyrene, Sterile |
| BD Falcon Centrifuge Tubes | VWR international | 21008-936 | 15ml, Sterile |
| Phenol:Chloroform:Isoamyl Alcohol (25:24:1 v/v/v) | Invitrogen | 15593-031 | UltraPure, 100ml |
| Amicon Ultra-4 Centrifugal Device | EMD Millipore | UFC803024 | Ultracel-30 membrane |
| 20X TE Buffer, Rnase free | Invitrogen | T11493 | 100ml |
| Glycoblue | Invitrogen | AM9516 | 15mg/ml |
References
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