Summary
Nous décrivons une méthode efficace pour séparer l'ADN simple brin, double brin de l'ADN et des molécules d'ARN à partir de l'environnement communautés virales. Les acides nucléiques sont fractionnés par chromatographie d'hydroxyapatite avec des concentrations croissantes de phosphate contenant du tampon. Cette méthode permet l'isolement de tous les types d'acides nucléiques viraux dans des échantillons environnementaux.
Abstract
Les virus, en particulier les bactériophages (phages), sont les entités biologiques les plus nombreux sur 1,2 Terre. Les virus de moduler l'abondance et la diversité de la cellule hôte, contribuent à le cycle des nutriments, de modifier l'hôte phénotype cellulaire, et l'influence de l'évolution de la cellule hôte et communautés virales à travers le transfert latéral des gènes 3. De nombreuses études ont mis en évidence la diversité stupéfiante génétique des virus et leur potentiel fonctionnel dans une variété de milieux naturels.
Techniques de métagénomique ont été utilisés pour étudier la diversité taxonomique et fonctionnelle des complexes potentiels assemblages viraux dont les membres contiennent l'ADN simple brin (ADNsb), l'ADN double brin (ADNdb) et les génotypes ARN 4-9. Les protocoles actuels de construction de bibliothèques utilisées pour étudier l'ADN ou d'ARN contenant l'environnement contenant des virus nécessitent un traitement initial nucléase afin d'éliminer les modèles non ciblées 10. Cependant, une compréhension globale de l'effectif du gène collective de la communauté du virus et la diversité du virus nécessite la connaissance de tous les membres indépendamment de la composition du génome. Le fractionnement des sous-types d'acides nucléiques purifiés fournit un mécanisme efficace par lequel l'étude des assemblages virale sans sacrifier une partie de la signature génétique de la communauté.
Hydroxyapatite, une forme cristalline du phosphate de calcium, a été employé dans la séparation des acides nucléiques, ainsi que des protéines et des microbes, depuis les années 1960 11. En exploitant l'interaction entre les responsables chargés positivement ions Ca 2 + de l'hydroxyapatite et le squelette phosphate chargé négativement des sous-types d'acides nucléiques, il est possible d'éluer préférentiellement chaque sous-type acide nucléique indépendant des autres. Nous avons récemment utilisé cette stratégie de manière indépendante fractionner les génomes de ADNsb, et de l'ARN-ADN double brin contenant des virus dans la préparation du séquençage de l'ADN 12. Ici, nous présentons une méthode pour le fractionnement et la récupération des ADNsb, ADNdb et l'ARN viral à partir d'acides nucléiques viraux assemblages mixtes utilisant chromatographie d'hydroxyapatite.
Protocol
1. Préparation des solutions
Avant d'effectuer la chromatographie d'hydroxyapatite, des tampons phosphates doivent être préparés et l'hydroxyapatite doivent être correctement hydraté.
- Solution de phosphate 1M, pH 6,8: Dans un flacon 1L dissoudre 119.98g de phosphate de sodium monobasique dans 1L d'stérile, traitée par DEPC H 2 O. Préparer un phosphate de sodium dibasique 1M solution dans un flacon de 1L en dissolvant 141.96g de phosphate de sodium dibasique dans 1L d'stérile, traitée par DEPC H 2 O. Combinez les mono-et di-solutions à un ratio de 1:1. Flacon Placer sur une plaque d'agitation et mélanger à l'aide d'un barreau magnétique. Ajuster le pH à 6,8 par addition d'hydroxyde de sodium (pour augmenter le pH) ou l'acide phosphorique (pour diminuer le pH).
- Tampon phosphate 0,12 M: Dans un flacon de 500ml, mélanger 30 ml de solution de phosphate 1M, pH 6,8, 2,5 ml de 10% de sodium dodécyl sulfate (SDS), et 5 ml de 0,5 M EDTA. Ajouter stérile, traitée par DEPC H2O à un volume de 225ml. Ajuster le pH à 6,8. Ajouter stérile, traitée par DEPC H2O 250ml. Autoclave.
- Tampon phosphate 0,18 M: Dans un flacon de 500ml, mélanger 45 ml de solution de phosphate 1M, pH 6,8, 2,5 ml de 10% de sodium dodécyl sulfate (SDS), et 5 ml de 0,5 M EDTA. Ajouter stérile, traitée par DEPC H 2 O pour un volume de 225ml. Ajuster le pH à 6,8. Ajouter stérile, traitée par DEPC H 2 O pour 250ml. Autoclave.
- Tampon phosphate 0,20 M: Dans un flacon de 500ml, mélanger 50 ml de solution de phosphate 1M, pH 6,8, 2,5 ml de 10% de sodium dodécyl sulfate (SDS), et 5 ml de 0,5 M EDTA. Ajouter stérile, traitée par DEPC H 2 O pour un volume de 225ml. Ajuster le pH à 6,8. Ajouter stérile, traitée par DEPC H 2 O pour 250ml. Autoclave.
- 0,40 M de tampon phosphate: dans un flacon de 500ml, 100ml de combiner de solution de phosphate 1M, pH 6,8, 2,5 ml de 10% de sodium dodécyl sulfate (SDS), et 5 ml de 0,5 M EDTA. Ajouter stérile, traitée par DEPC H 2 O pour un volume de 225ml. Ajuster le pH à 6,8. Ajouter stérile, traitée par DEPC H 2 O pour 250ml. Autoclave.
- "Tampon phosphate 1,00 M" (concentration réelle de phosphate dans cette solution est 0,91 M): Dans un flacon de 500ml, mélanger 30 ml de solution de phosphate 1M, pH 6,8, 2,5 ml de 10% de sodium dodécyl sulfate (SDS), et 5 ml de 0,5 M d'EDTA. Ajouter stérile, traitée par DEPC H2O à un volume de 225ml. Ajuster le pH à 6,8. Ajouter stérile, traitée par DEPC H 2 O pour 250ml. Autoclave.
- Hydratation Hydroxyapatite: Poids à 1g d'hydroxyapatite et d'ajouter à un tube de 50ml. Ajouter 6ml de tampon phosphate 0,12 M à l'hydroxyapatite et renverser pour mélanger. Avant d'utiliser porter la température à 60 ° C et bien mélanger. Store pour les longues périodes de temps à 4 ° C.
- Avant d'utiliser, à équilibrer tous les tampons phosphate et d'hydroxyapatite hydratés à 60 ° C.
2. Préparation de Econo-Colonne
- Fermer le robinet. Rincez plusieurs fois la colonne désionisée H 2 O par les reprises inversant la colonne et la décantation.
- Retirer le robinet de l'Econo-colonne et la colonne de l'autoclave pour stériliser.
- Remplacer et fermer le robinet. Ajouter 1ml de Sigmacote à l'stériles Econo-colonne et manteau de toutes les surfaces vitrées. Ouvrir le robinet et décanter.
- Fixez colonne pour un bain d'eau circulant et régler la température à 60 ° C. Pour einsure le moins de perte de chaleur à travers la colonne de la colonne d'emballage dans un agent isolants tels que du papier d'aluminium ou d'isolation des tuyaux en mousse est recommandé.
- Rincer la colonne de Econo-deux fois avec stérile, exempt de RNase H 2 O puis deux fois avec stérile, sans RNase tampon phosphate 0,12 M.
3. Chromatographie Hydroxypaptite
- S'assurer que le robinet est fermé, ajoutez lentement 2 ml de pré-préparés, l'hydroxyapatite en suspension au fond de l'Econo-colonne en utilisant une pipette stérile 2ml sérologique.
- Autoriser l'hydroxyapatite de s'installer sous la force de gravité pendant 30 minutes.
- Égoutter tampon de colonne et robinet à proximité. Combinez les acides nucléiques avec un tampon phosphate 0,12 M dans un volume final de 500 pl et incuber à 60 ° C pendant 10 minutes dans un bloc chauffant ou un bain d'eau.
- D'appliquer rapidement les acides nucléiques préparés dans un tampon phosphate 0,12 M à l'hydroxyapatite aide d'une pipette sérologique de 2 ml en veillant à ne pas perturber la colonne.
- Autoriser les acides nucléiques de se lier à l'hydroxyapatite pendant 30 minutes.
- Placer un tube 15ml sous la colonne, ouvrir le robinet et recueillir l'échantillon initial contenant ADNsb. Fermer le robinet.
- Ajouter 6ml de tampon phosphate 0,12 M à l'hydroxyapatite en veillant à ne pas perturber la colonne, ouvrir le robinet et recueillir l'ADN simple brin dans le tube de 15ml de l'étape précédente. Fermer le robinet.
- Ajouter 1 volume d'un phénol: chloroforme: alcool isoamylique (25:25:1 v / v / v) dans le tube, mélanger vigoureusement et centrifuger à 3500 xg pendant 15 minutes. Transférer le surnageant contenant ADNss dans un nouveau tube 15ml.
- Répétez 3,76 et 3,87 en utilisant 6ml de tampon phosphate 0,20 M à l'eluth et ARN purifier de la colonne en veillant à utiliser un nouveau tube 15ml pour la collecte.
- Répétez 3,76 et 3,87 en utilisant 6ml de tampon phosphate 0,40 m pour éluer et purifier ADNdb de la colonne en veillant à utiliser un nouveau tube 15ml pour la collecte.
- Répétez 3,76 et 3,87 en utilisant 6ml de tampon phosphate 1,00 M à la bande de la colonne de toute ADNdb résiduelle en veillant à utiliser un nouveau tube 15ml pour la collecte.
4. Dessalage échantillons d'acide nucléique
- Transfert 4-5ml d'échantillon à une Amicon Ultra-4 dispositif centrifuge de filtre équipé d'un poids moléculaire de 30 000 coupé la membrane Ultracel.
- Concentré échantillon à <500μl par centrifugation à 6000 xg, 30 ° C, à 5 minutes (ou jusqu'à ce que le volume concentré est atteint) dans un rotor à angle fixe. Jeter les traverser.
- Ajouter le reste de l'échantillon (s) pour Amicon Ultra-4 dispositif de filtre centrifuge et porter le volume jusqu'à 4 à 5 ml avec du tampon 1X RNAse TE.
- Concentré échantillon à <500μl par centrifugation à 6000 xg, 30 ° C, à 5 minutes (ou jusqu'à ce que le volume concentré est atteint) dans un rotor à angle fixe. Jeter les traverser.
- Ajouter 4 à 5 ml de RNAse tampon 1X TE Amicon Ultra-4 dispositif de filtre centrifuge. Concentré échantillon à <500μl par centrifugation à 6000 xg, 30 ° C, à 5 minutes (ou jusqu'à ce que le volume concentré est atteint) dans un rotor à angle fixe. Jeter les traverser.
- Répétez l'étape 4.5 un supplément de 5 fois pour dessaler complètement échantillon d'acide nucléique (s).
- Transférer l'échantillon restant (s) dans un tube stérile 1.7ml Eppendorf. Ajouter 1/10ème du volume d'acétate de sodium 3M, pH 7,0, deux volumes d'éthanol 100%, et 1 microlitre d'Glycoblue. Mélangez bien au vortex.
- Centrifuger à 28000 xg, 4 ° C, 60 minutes. Décanter veillant à ne pas perturber le culot. Ajouter 300μl d'éthanol à 70%. Centrifuger à 28000 xg température ambiante, pendant 10 minutes. Décanter, sec et remettre chaque fraction dans un volume approprié de RNase tampon TE.
5. Les résultats représentatifs:
La figure 1 récapitule les méthodes présentées pour l'utilisation de la chromatographie d'hydroxyapatite de fractionner ADNsb, ADNdb et des acides nucléiques ARN à partir d'un assemblage mixte virale. Cette méthode exploite l'interaction entre la charge de squelette phosphate chargé négativement des acides nucléiques et les chargés positivement ions Ca 2 + présent dans l'hydroxyapatite et permet le fractionnement efficace de sous-types d'acides nucléiques (ADN simple brin, ADN double brin et ARN) avec des concentrations croissantes de tampon phosphate 12.
Le fractionnement d'hydroxyapatite in vitro "communauté" des ADNss connue (M13mp18), ADNdb (lambda) et l'ARN (MS2 et phi6) génomes viraux est illustrée dans la Figure 2. Les acides nucléiques ont été combinées à des concentrations égales, appliquées à la colonne d'hydroxyapatite et ont été élues en utilisant une concentration croissante de tampon phosphate. Chaque sous-type acide nucléique élue indépendante des autres avec moins de 9% le report d'une fraction à la suivante.
L'application de cette technique pour les acides nucléiques isolés à partir d'une communauté virale recueillies auprès de la baie de Chesapeake est montré dans la figure 3. Le rendement total d'acide nucléique isolé à partir de virus purifié a été appliquée à la colonne d'hydroxyapatite. Matériel génomique composé d'ADN simple brin, l'ARN et ADN double brin a été éluée avec 0,12 M de manière indépendante, et les concentrations de 0,20 M de tampon phosphate 0.40M/1.00M respectivement. ADN double-brin est élue à la concentration de phosphate de 0.40m et 1.00m et dans ce cas, domine cette communauté virale par rapport à génotypes ADNsb et l'ARN. Cette observation est cohérente avec la composition de la communauté virale attendue des milieux marins et estuariens où la majorité des acides nucléiques sont récupérables ADNdb 13.
Schéma Figure 1. De la méthode de chromatographie d'hydroxyapatite pour le fractionnement des acides nucléiques. Un mélange de ADNsb, ADNdb et l'ARN préparés dans un tampon phosphate 0,12 M est chauffé à 60 ° C et appliqués à une colonne d'hydroxyapatite maintenu à une constante de 60 ° C en utilisant un bain d'eau circulant. Les acides nucléiques (ADN simple brin, l'ARN et ADN double brin) sont élues de la hydroxyapatite avec des concentrations croissantes d'un tampon phosphate contenant. Ce chiffre a été reproduite avec la permission de la Société américaine de microbiologie et a été initialement présenté dans Andrews-Pfannkoch et al. 2010 12.
Figure 2. Séparation des acides nucléiques viraux connus en utilisant la chromatographie d'hydroxyapatite. Des concentrations égales de M13mp18 ADNsb, MS2 ssRNA, phi6 ARNdb et lambda ADNdb (voies 2-5, respectivement) ont été combinés (piste 6) et appliqués à une colonne d'hydroxyapatite. Single-brin d'ADN (M13mp18), l'ARN (MS2/phi6) et ADNdb (lambda) étaient indépendamment éluée de la colonne d'hydroxyapatite en utilisant 0,12 M (piste 8), 0,18 M (voie 9) et 0.40M/1.00M (voie 10) . Une échelle 1kb (voies 1, 7) a été utilisée pour confirmer tailles de génome. Ce chiffre a été reproduite avec la permission de la Société américaine de microbiologie et a été initialement présenté dans Andrews-Pfannkoch et al. 2010 12.
Figure 3. Séparation des acides nucléiques viraux isolés à partir d'une communauté au sein de la baie de Chesapeake. Les acides nucléiques ont été isolés et appliqués à une colonne d'hydroxyapatite. ADNss (voie 0,12 M), l'ARN (voie 0,20 M) et ADNdb (voies 0.40M/1.0M) ont été élues en utilisant de manière indépendante des concentrations de tampon phosphate de 0,12 M, 0,20 M et 0.40M/1.00M, respectivement. Échelle Salut l'ADN de masse (voie L1) et Ladder 1kb (piste L2) ont été utilisés pour confirmer visuellement approximative poids moléculaire et la masse des acides nucléiques. Ce chiffre a été reproduite avec la permission de la Société américaine de microbiologie et a été initialement présenté dans Andrews-Pfannkoch et al. 2010 12.
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Discussion
La méthodologie présentée ici chromatographie d'hydroxyapatite est un outil très efficace et robuste pour le fractionnement des acides nucléiques à partir des assemblages mixtes virales, lorsque l'objectif est d'étudier la composition des acides nucléiques totaux de la communauté. Généralement, ADNsb, ARN et ADN double brin sera élue de la colonne de concentration pho tampon phosphate supérieure à environ 0,40 m ~ 0et respectivement. Cependant, chaque préparation d'hydroxyapatite peuvent avoir une composition légèrement différente et le profil d'élution de sorte qu'il est important de tester chaque préparation en utilisant connues des acides nucléiques (par exemple partir d'une préparation de virus cultivés). Cela permettra à l'utilisateur de déterminer les concentrations de phosphate spécifiques contenant des tampons nécessaires pour éluer les acides nucléiques désiré.
Un facteur limitant de cette technique est la quantité de disponibles ions Ca 2 + présent dans l'hydroxyapatite qui peut lier le squelette phosphate des acides nucléiques. Le capacityamount de l'hydroxyapatite dans la colonne peut être agrandie ou réduite à la colonne (dicté par la taille de chemise d'eau de colonne et le montant de l'hydroxyapatite utilisée) et le volume des tampons utilisés pour l'élution peut être agrandie ou réduite pour accueillir tout petit ou de très grandes quantités d'acides nucléiques d'entrée, mais est finalement limitée par la taille de la colonne à chemise d'eau.
De plus, une technique de batch où les acides nucléiques, l'hydroxyapatite et le phosphate contenant les tampons sont combinés dans un tube, mélangés et centrifugés à faible vitesse est une autre façon d'isoler les acides nucléiques ciblés. Cette stratégie peut être bénéfique dans certains cas, mais n'est pas aussi fiable que les méthodes chromatographiques qui sont plus précis et offrir un meilleur fractionnement des acides nucléiques.
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Disclosures
Aucun conflit d'intérêt déclaré.
Acknowledgments
Cette recherche a été soutenue par l'Office of Science (BER), Département américain de l'Énergie, Accord de coopération non. De-FC02-02ER63453, la National Science Foundation Programme de séquençage du génome microbien (numéros 0,626,826 et 0,731,916 prix). Nous remercions John Glass pour son expertise technique et des conseils et K. Eric Wommack pour son aide dans la collecte des échantillons environnementaux.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Econo-Column | Bio-Rad | 737-0717 | 0.7cm ID package/2 |
| Hydroxyapatite | Bio-Rad | 130-0520 | DNA Grade Bio-Gel HTP Gel, 100g/td> |
| Sodium Phosphate, Monobasic | VWR international | VW1497-01 | Monohydrate, Crystal 500g |
| Sodium Phosphate, Dibasic | VWR international | VW1496-01 | Anhydrous, Powder 500g |
| DEPC-treated Water | Invitrogen | AM9922 | 1L |
| 10% SDS Solution | Invitrogen | 24730-020 | UltraPure, 1L |
| 0.5M EDTA | Invitrogen | AM9262 | pH 8.0, 1L |
| Sigmacote | Sigma-Aldrich | SL2-25ML | |
| 2ml serological pippette | VWR international | 89130-884 | Polystyrene, Sterile |
| BD Falcon Centrifuge Tubes | VWR international | 21008-936 | 15ml, Sterile |
| Phenol:Chloroform:Isoamyl Alcohol (25:24:1 v/v/v) | Invitrogen | 15593-031 | UltraPure, 100ml |
| Amicon Ultra-4 Centrifugal Device | EMD Millipore | UFC803024 | Ultracel-30 membrane |
| 20X TE Buffer, Rnase free | Invitrogen | T11493 | 100ml |
| Glycoblue | Invitrogen | AM9516 | 15mg/ml |
References
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