Summary
Protocol
- 안티 CD4 + biotinlayted 표면 microfluidic 채널을 준비합니다.
- 주사기 펌프와 microfluidic 채널에 5 ML / 분 샘플 혈액의 10 ML을 주사.
- PBS로 20 분 20 ML / 분 혈액을 밖으로 플러시.
- 15 분 5ul/min에 희석 외과 lysing 솔루션 (PBS로 재고 솔루션에서 10 % 희석) 주사.
- 15 분 알을 품다.
- 5 ML / 20 분 분 주요 인 경우에는 3 번 CD + 항체 솔루션 (PBS로 재고 솔루션에서 10 % 희석) 주사.
- 2 시간 동안 부화.
- 5 ML / 15 분 분 PBS와 채널을 플러시.
- 동시에 20 분 5 ML / 분 20 % AF488 CD4 + 항체, 0.2 % DAPI 주식 솔루션,와 10 %의 보조 인 경우에는 3 번 CD + 항체를 주사.
- 20 분 품어.
- 5 ML / 15 분 분 PBS와 채널을 플러시.
- 형광 현미경으로 세포를 개수 :
- 화이트 (광학) - 흑백 : 셀 및 먼지
- UV (DAPI) - 블루 : 세포에만
- 블루 (CD4 +) - 초록색 : T - 림프구와 단핵구
- 그린 (인 경우에는 3 번 CD +) - 빨간색 : T - 림프구 전용
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Materials
Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
PDMS microchannel | Fabricated by SU-8 mold | |||
Blood | Donated blood from normal human subject. Mass General Hospital, 10 X high density WBC or Brigham and Women’s Hospital. | |||
PBS | Buffer | Invitrogen | 14190 | 1x Dulbecco’s Phosphated Buffered Saline. |
FACS lysing solution | BD Biosciences | 349202 | Diluted to 10% from stock solution with PBS. | |
Anti-CD4+ biotinlayted Ab | Beckman Coulter Inc. | IM0704 | Surface prepared with Anti-CD4+ biotinlayted Ab, diluted to 10% from stock solution with PBS/BSA after mixing with 0.2mg stock and 1ml deionized water. | |
goat anti-hCD3delta | pAB | Santa Cruz Biotechnology, Inc. | sc-1128 | Diluted to 10% from stock solution with PBS |
rabbit anti-goat IgG PE | Santa Cruz Biotechnology, Inc. | sc-3755 | Secondary Ab fro anti-CD3 Ab, diluted to 10% from stock solution with PBS | |
anti-human CD4+ | BD Biosciences | 557695 | Alexa Fluor 488 labeled, diluted to 20% from stock solution with PBS. | |
DAPI | Invitrogen | D1306 | 4’,6-dianidino-2-phenylindole, dihydrochloride solution, diluted to 0.2% from stock solution with PBS. |