Summary
Protocol
- 抗CD4 + biotinlayted表面とマイクロ流体チャネルを準備します。
- シリンジポンプとマイクロ流体チャネルに5ml /分でサンプルの血液10mlを注入する。
- PBSで20分間20ml /分で血を洗い流す。
- 15分間5ul/minで希釈FACS溶解溶液を(PBSで原液から10%に希釈)を注入。
- 15分間インキュベートする。
- 20分間5ml /分で一次CD3 +抗体溶液を(PBSで原液から10%に希釈)を注入。
- 2時間インキュベートします。
- 15分間を5 ml / minでPBSでチャンネルを洗い流す。
- 同時に20分間、5ml /分で20%AF488 CD4 +抗体、0.2%DAPI原液、および10%の二次CD3 +抗体を注入する。
- 20分間インキュベートする。
- 15分間を5 ml / minでPBSでチャンネルを洗い流す。
- 蛍光顕微鏡下で細胞を数える。
- ホワイト(光) - 黒と白:セルとほこり
- UV(DAPI) - 青:セルのみ
- ブルー(CD4 +) -緑:T -リンパ球と単球
- グリーン(CD3 +) -赤:T -リンパ球のみ
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Materials
Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
PDMS microchannel | Fabricated by SU-8 mold | |||
Blood | Donated blood from normal human subject. Mass General Hospital, 10 X high density WBC or Brigham and Women’s Hospital. | |||
PBS | Buffer | Invitrogen | 14190 | 1x Dulbecco’s Phosphated Buffered Saline. |
FACS lysing solution | BD Biosciences | 349202 | Diluted to 10% from stock solution with PBS. | |
Anti-CD4+ biotinlayted Ab | Beckman Coulter Inc. | IM0704 | Surface prepared with Anti-CD4+ biotinlayted Ab, diluted to 10% from stock solution with PBS/BSA after mixing with 0.2mg stock and 1ml deionized water. | |
goat anti-hCD3delta | pAB | Santa Cruz Biotechnology, Inc. | sc-1128 | Diluted to 10% from stock solution with PBS |
rabbit anti-goat IgG PE | Santa Cruz Biotechnology, Inc. | sc-3755 | Secondary Ab fro anti-CD3 Ab, diluted to 10% from stock solution with PBS | |
anti-human CD4+ | BD Biosciences | 557695 | Alexa Fluor 488 labeled, diluted to 20% from stock solution with PBS. | |
DAPI | Invitrogen | D1306 | 4’,6-dianidino-2-phenylindole, dihydrochloride solution, diluted to 0.2% from stock solution with PBS. |