En etylenglykol-basert forglassing metode for mus embryo er beskrevet. Det er en fordel til andre metoder i sin enkelhet og lave embryonale toksisitet, og derfor kan grovt anvendelig til mange stammer av mus, inkludert innavlet og genmodifiserte mus.
Kryokonservering av mus embryo er et teknologisk grunnlag som støtter biomedisinske fag, fordi mange stammer av mus har blitt produsert av genetiske modifikasjoner og antallet er stadig økende år for år. Den tekniske utviklingen startet med langsom frysing metoder i 1970 1, deretter fulgt av forglassing metoder utviklet på slutten av 1980-tallet to. Vanligvis er den sistnevnte teknikken fordelaktige i sin hurtighet, enkelhet, og høy overlevelsesevne gjenvunnet embryoer. Men cryoprotectants inneholdt er svært giftig og kan påvirke etterfølgende embryo utvikling. Derfor ble teknikken ikke gjelder for visse stammer av mus, selv når løsningene er avkjølt til 4 ° C for å redusere den toksiske effekten under embryo håndtering. På Riken Bioresource Center, er mer enn 5000 mus stammer med ulike genetiske bakgrunn og fenotyper vedlikeholdt 3, og derfor har vi optimalisert en forglassing technique som kan vi cryopreserve embryo fra mange forskjellige stammer av mus, med fordelene av høy embryo overlevelse etter vitrifying og tining (eller liquefying, mer presist) ved omgivelsestemperatur fire.
Her presenterer vi en forglassing metode for mus embryo som har blitt brukt på senteret vårt. Den nedfrysing Løsningen inneholder etylenglykol istedenfor DMSO å minimere toksisiteten til foster 5. Den inneholder også Ficoll og sukrose for forebygging av devitrification og osmotisk regulering, henholdsvis. Befruktede egg kan håndteres ved romtemperatur og overført til flytende nitrogen innen 5 min. Fordi den opprinnelige metoden ble optimalisert for plast sugerør som beholdere, har vi litt modifisert protokollen for cryotubes, som er lettere tilgjengelig i laboratorier og mer motstandsdyktig mot fysiske skader. Vi har også beskrive prosedyren for tining vitrified embryo i detalj fordi det er en kritisk step for en effektiv utvinning av levende mus. Disse metoder ville være nyttig for forskere og teknikere som trenger bevaring av musen stammer for senere bruk i en sikker og kostnadseffektiv måte.
Siden den første rapporten om musen embryo forglassing av Rall og Fahy i 1985 2, har flere tekniske forbedringer er gjort for å øke overlevelsesevnen til foster etter tining. En av de mest vellykkede endringer ble oppnådd ved bruk av etylenglykol som cryoprotectant grunn av sin lave toksisitet og høy membran-permeabilitet. Slike fordeler gjør oss i stand til å håndtere frysing embryoer ved romtemperatur 4; andre forglassing metodene krever embryo overlate ved kjøligere temperaturer og er ikke alltid gjelder noen stammer av mus inkludert BALB / c 6. Den første etylenglykol-baserte forglassing ble utviklet av Kasai et al. i 1990 5,7. Fordi den opprinnelige metoden ble optimalisert for plast sugerør som beholdere, har vi litt modifisert protokollen for cryotubes, som er lettere tilgjengelig i laboratorier og mer motstandsdyktig mot fysiske skader. Derfor kan forglassing metoden beskrevet her være applicable til mange laboratorier bruker mus som forskning modeller. Den samme metoden kan også brukes for mus embryo ved morula og blastocyst stadier 8 og rotte embryoer 9. Vi har imidlertid nylig funnet ut at kvaliteten på cryotubes kan påvirke overlevelsen av befruktede egg etter frysing-tining. Derfor er det viktig å undersøke innsiden av cryotubes for sin glatthet før vitrifying embryoer (f.eks; se på Table av spesifikke reagenser og utstyr).
Forglassing metoder har mange fordeler fremfor konvensjonelle langsom frysing metoder, men de iboende har en ulempe i forhold til transport formål. Som vitrified embryo bør holdes på under -120 ° C for å opprettholde sin levedyktighet, er tørre skipere vanligvis brukt for deres sikker transport. Tørr skipere er tunge og klumpete, og deres rundtur er dyrt, spesielt for internasjonal transport. Vi er nå ferd med å utvikle en ny forglassing metode vedsom vitrified embryo kan lagres på tørris temperatur (ca -80 ° C) i minst 7 dager 10. Denne metoden bør være forglassing av neste generasjon.
The authors have nothing to disclose.
Denne studien ble gjennomført i samarbeid med National Bioresource Project, Kunnskapsdepartementet, Kultur, Sport, Science and Technology, Japan.
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
Bovine serum albumin | Merck Biosciences (Calbiochem) | 12657 | |
Ethylene glycol | Wako Pure Chemical Industries | 058-00986 | |
Ficoll 70 | GE Healthcare | 17-0310-10 | |
Glucose | Wako Pure Chemical Industries | 041-00595 | |
NaCl | Wako Pure Chemical Industries | 191-01665 | |
KCl | Wako Pure Chemical Industries | 163-03545 | |
KH2PO4 | Wako Pure Chemical Industries | 169-04245 | |
Na2HPO4·12H2O | Wako Pure Chemical Industries | 500-04195 | |
MgCl2 ·6H2O | Wako Pure Chemical Industries | 135-00165 | |
CaCl2 ·2H2O | Wako Pure Chemical Industries | 031-00435 | |
Penicillin G | Sigma-Aldrich | P-4687 | |
Sodium pyruvate | Sigma-Aldrich | P-8574 | |
Sucrose | Wako Pure Chemical Industries | 196-00015 | |
M16 medium | Sigma-Aldrich | M7292 | |
M2 medium | Sigma-Aldrich | M7167 | |
Cryotube | Sumitomo Bakelite | MS-4501 | “Cryogenic Vial” |