En ethylen glycol-baserede forglasning metode til mus embryoner er beskrevet. Det er en fordel for andre metoder i sin enkelhed og lave embryonale toksicitet, og kan derfor være bredt anvendelige til mange stammer af mus, herunder indavlede og gen-modificerede mus.
Kryopræservering af mus embryoner er et teknologisk grundlag, der understøtter biomedicinske videnskaber, fordi mange stammer af mus er produceret af genetiske modifikationer og antallet er konstant stigende år for år. For den tekniske udvikling startede med langsom frysemetoders i 1970'erne 1, og derefter efterfulgt af forglasning metoder udviklet i slutningen af 1980'erne 2. Generelt er Sidstnævnte teknik er en fordel i sin hurtighed, enkelhed, og høj overlevelsesevne af nyttiggjort embryoner. Men den indeholdt cryoprotectants er meget giftige og kan påvirke den efterfølgende embryo udvikling. Derfor er teknikken ikke fandt anvendelse på visse stammer af mus, selv når løsninger er nedkølet til 4 ° C for at mindske den toksiske effekt i løbet af embryo håndtering. På Riken BioResource Center, er mere end 5000 mus stammer med forskellig genetisk baggrund og fænotyper vedligeholdt 3, og derfor har vi optimeret en forglasning technique som vi kan Cryopreservering embryoner fra mange forskellige stammer af mus, med fordelene ved høje embryo overlevelse efter vitrifying og optøning (eller flydende, mere præcist) ved den omgivende temperatur 4.
Her præsenterer vi et forglasning metode til mus embryoner, der har været anvendt med succes i vores center. Den kryopræservering opløsning indeholder ethylenglycol i stedet for DMSO at minimere toksicitet over for embryoner 5. Den indeholder også Ficoll og saccharose til forebyggelse af devitrification og osmotisk justering, hhv. Embryoner kan håndteres ved stuetemperatur og overføres til flydende nitrogen inden for 5 min. Fordi den oprindelige metode er blevet optimeret til plast sugerør som beholdere, har vi ændret lidt protokollen for cryotubes, som er mere let tilgængelige i laboratorier og mere modstandsdygtige over for fysiske skader. Vi har også beskrive proceduren efter optøning forglasset embryoner i detaljer, fordi det er en kritisk step for effektiv inddrivelse af levende mus. Disse metoder ville være en hjælp til forskere og teknikere, der har brug for bevarelse af musen stammer til senere brug på en sikker og omkostningseffektiv måde.
Siden den første rapport af mus embryo forglasning ved Rall og Fahy i 1985 2, har flere tekniske forbedringer er foretaget for at øge overlevelsesevne embryoner efter optøning. En af de mest succesfulde ændringer blev opnået ved brug af ethylenglycol som en kryoprotektant på grund af dets lave toksicitet og høj membran-permeabilitet. Sådanne fordele kunne håndtere nedfrysning embryoner ved stuetemperatur 4; andre forglasning metoder kræver embryo aflevering ved køligere temperaturer og er ikke altid gælder for nogle stammer af mus herunder BALB / C 6. Den første ethylen glycol-baserede forglasning blev udviklet af Kasai et al. i 1990 5,7. Fordi den oprindelige metode er blevet optimeret til plast sugerør som beholdere, har vi ændret lidt protokollen for cryotubes, som er mere let tilgængelige i laboratorier og mere modstandsdygtige over for fysiske skader. Derfor kan forglasning metoden beskrevet her være calicable at mange laboratorier med mus som forskning modeller. Samme metode kan også bruges til mus embryoner på morula og blastocyst stadier 8 og rotte embryoner 9. Men vi har for nylig fundet, at kvaliteten af cryotubes kan påvirke overlevelse af fostre efter frysning-optøning. Derfor er det vigtigt at undersøge indersiden af cryotubes for sin glathed før vitrifying embryoner (f.eks, se på Tabel over specifikke reagenser og udstyr).
Forglasning metoder har mange fordele frem for traditionelle langsomme frysemetoders, men de i sagens natur har en ulempe i forhold til transport formål. Som forglasset embryoner skal opbevares ved under -120 ° C for at bevare deres levedygtighed, er tørre afskibere generelt bruges til deres sikker transport. Tør afskibere er tunge og pladskrævende, og deres tur er dyrt, især for international transport. Vi er nu ved at udvikle en ny forglasning metodesom forglasset embryoner kan opbevares ved tør-is temperatur (ca. -80 ° C) i mindst 7 dage 10. Denne metode bør være forglasning af den næste generation.
The authors have nothing to disclose.
Denne undersøgelse blev gennemført i samarbejde med National BioResource Project, Ministeriet for Undervisning, Kultur, Sport, Videnskab og Teknologi, Japan.
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
Bovine serum albumin | Merck Biosciences (Calbiochem) | 12657 | |
Ethylene glycol | Wako Pure Chemical Industries | 058-00986 | |
Ficoll 70 | GE Healthcare | 17-0310-10 | |
Glucose | Wako Pure Chemical Industries | 041-00595 | |
NaCl | Wako Pure Chemical Industries | 191-01665 | |
KCl | Wako Pure Chemical Industries | 163-03545 | |
KH2PO4 | Wako Pure Chemical Industries | 169-04245 | |
Na2HPO4·12H2O | Wako Pure Chemical Industries | 500-04195 | |
MgCl2 ·6H2O | Wako Pure Chemical Industries | 135-00165 | |
CaCl2 ·2H2O | Wako Pure Chemical Industries | 031-00435 | |
Penicillin G | Sigma-Aldrich | P-4687 | |
Sodium pyruvate | Sigma-Aldrich | P-8574 | |
Sucrose | Wako Pure Chemical Industries | 196-00015 | |
M16 medium | Sigma-Aldrich | M7292 | |
M2 medium | Sigma-Aldrich | M7167 | |
Cryotube | Sumitomo Bakelite | MS-4501 | “Cryogenic Vial” |