En etylenglykol-baserad förglasning metod för musembryon beskrivs. Det är fördelaktigt att andra metoder i sin enkelhet och låga embryonala toxicitet, och därför kan brett tillämpbar för många stammar av möss, inklusive inavlade och genmodifierade möss.
Frysförvaring av musembryon är en teknisk grund som stöder Biomedicinsk vetenskap, eftersom många stammar av möss har producerats av genetisk modifiering och antalet är konstant ökar för varje år. Den tekniska utvecklingen började med långsam frysning metoder under 1970-talet 1, därefter följt av förglasning metoder utvecklades i slutet av 1980-talet 2. Generellt sett är det senare tekniken fördelaktigt i sin snabbhet, enkelhet och hög överlevnadsförmåga av återvunnen embryon. Men de innehöll cryoprotectants är mycket giftiga och kan påverka efterföljande embryo utveckling. Därför var tekniken inte är tillämplig på vissa stammar av möss, även om lösningarna kyls ned till 4 ° C för att minska den toxiska effekten under embryo hantering. Vid RIKEN Bioresource Center, är mer än 5000 musstammar med olika genetisk bakgrund och fenotyper underhålls 3, och därför har vi optimerat en förglasning technique som vi kan cryopreserve embryon från många olika stammar av möss, med fördelarna av hög embryots överlevnad efter vitrifying och upptining (eller kondensering, närmare bestämt) vid omgivningstemperatur 4.
Här presenterar vi ett förglasning metod för mus embryon som har använts med framgång vid vårt center. Den frysförvaring lösningen innehåller etylenglykol istället för DMSO att minimera toxiciteten till embryon 5. Den innehåller också Ficoll och sackaros för att förebygga devitrification och osmotiska justering, respektive. Embryon kan hanteras i rumstemperatur och överföras till flytande kväve inom 5 minuter. Eftersom den ursprungliga metoden var optimerad för plast-strån som behållare, har vi ändrat något protokoll för cryotubes, som är mer lättillgängliga i laboratorier och mer motståndskraftiga mot fysiska skador. Vi beskriver också förfarandet för upptining förglasat embryon i detalj eftersom det är en kritisk step för effektiv återvinning av levande möss. Dessa metoder skulle vara till hjälp för forskare och tekniker som behöver bevaras musstammar för senare användning på ett säkert och kostnadseffektivt sätt.
Sedan den första rapporten av mus embryo förglasning av Rall och Fahy 1985 2, har flera tekniska förbättringar gjorts för att öka överlevnadsförmågan av embryon efter upptining. En av de mest framgångsrika förändringar uppnåddes genom användning av etylenglykol som frysskyddsmedel grund av sin låga giftighet och hög membran-permeabilitet. Sådana fördelar kan vi hantera frysa embryon vid rumstemperatur 4, andra förglasning metoder kräver embryot dela på svalare temperaturer och är inte alltid tillämpliga på vissa stammar av möss, inklusive BALB / c 6. Den första etylenglykol-baserade förglasning har utvecklats av Kasai et al. 1990 5,7. Eftersom den ursprungliga metoden var optimerad för plast-strån som behållare, har vi ändrat något protokoll för cryotubes, som är mer lättillgängliga i laboratorier och mer motståndskraftiga mot fysiska skador. Därför kan förglasning metoden som beskrivs här kan applicable för många laboratorier som använder möss som forskning modeller. Samma metod kan också användas för mus embryon vid morula och blastocyst steg 8 och embryon råtta 9. Vi har dock funnit nyligen att kvaliteten på cryotubes kan påverka överlevnaden av embryon efter frysning-upptining. Därför är det viktigt att undersöka insidan av cryotubes för sin jämnhet innan vitrifying embryon (t.ex., se till Tabell över specifika reagenser och utrustning).
Förglasning metoder har många fördelar jämfört med konventionella långsam frysning metoder, men de i sig har en nackdel i förhållande till transporter syfte. Som förglasat embryon bör hållas lägre än -120 ° C för att bibehålla sin livskraft, är torra avlastare som allmänt används för säker transport. Torr avlastare är tunga och skrymmande, och deras rundresa är dyrt, särskilt för internationella transporter. Vi är nu utvecklar för närvarande en ny förglasning metodsom förglasat embryon kan förvaras vid torr-is temperatur (ca -80 ° C) under minst 7 dagar 10. Denna metod bör vara förglasning av nästa generation.
The authors have nothing to disclose.
Denna studie genomfördes i samarbete med National Bioresource Project, ministeriet för utbildning, kultur, sport, vetenskap och teknik, Japan.
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
Bovine serum albumin | Merck Biosciences (Calbiochem) | 12657 | |
Ethylene glycol | Wako Pure Chemical Industries | 058-00986 | |
Ficoll 70 | GE Healthcare | 17-0310-10 | |
Glucose | Wako Pure Chemical Industries | 041-00595 | |
NaCl | Wako Pure Chemical Industries | 191-01665 | |
KCl | Wako Pure Chemical Industries | 163-03545 | |
KH2PO4 | Wako Pure Chemical Industries | 169-04245 | |
Na2HPO4·12H2O | Wako Pure Chemical Industries | 500-04195 | |
MgCl2 ·6H2O | Wako Pure Chemical Industries | 135-00165 | |
CaCl2 ·2H2O | Wako Pure Chemical Industries | 031-00435 | |
Penicillin G | Sigma-Aldrich | P-4687 | |
Sodium pyruvate | Sigma-Aldrich | P-8574 | |
Sucrose | Wako Pure Chemical Industries | 196-00015 | |
M16 medium | Sigma-Aldrich | M7292 | |
M2 medium | Sigma-Aldrich | M7167 | |
Cryotube | Sumitomo Bakelite | MS-4501 | “Cryogenic Vial” |