För att utvärdera nya behandlingsmetoder paradigm för behandling av gliom, fysiologiska relevanta modeller är väsentliga. Vi använder en implanterbar förfarande styrskruven för etablering av intrakraniell xenograft modeller som är snabbare och säkrare än stereotaktisk strategier.
Ympning av humana tumörceller i hjärnan av immunsupprimerade möss är en etablerad metod för att studera hjärnan cancerformer, inklusive glioblastom (gliom) och medulloblastom. Den utbredda stereotaktisk metod tillåter endast för injektion av ett enda djur i taget, är arbetskraftsintensiv och kräver högt specialiserad utrustning. Styrskruven Metoden, som ursprungligen utvecklats av Lal et al. 1 utvecklades för att eliminera besvärliga stereotaktisk förfaranden. Vi beskriver nu en uppdaterad strategi guide skruv som är snabb och extremt säker, som båda är viktiga etiska överväganden. Framför allt innehåller vårt förfarande nu en infusionspump som gör att upp till 10 djur som ska samtidigt injiceras med tumörceller.
För att visa nyttan av detta förfarande har vi etablerat mänskliga U87MG gliom celler intrakraniella implanterad hos möss, som sedan behandlades med AMG102, en human antikropp riktad mot HGF / skingra faktor genomgår för närvarande klinisk utvärdering 2-5. Systemisk injektion av AMG102 förlängde signifikant överlevnad av alla möss med intrakraniell U87MG implanterad och resulterat i ett antal komplett botemedel.
Denna studie visar att styrskruven metoden är ett billigt, mycket reproducerbar metod för att fastställa intrakraniella implanterad. Dessutom ger det en relevant fysiologisk modell för validering av nya behandlingsstrategier för behandling av hjärnan cancer.
Den intrakraniell styrskruven metod som presenteras här möjliggör snabb och reproducerbar etablering av intrakraniell implanterad och i händerna på en utbildad djur tekniker, är detta förfarande mycket lätt utföras utan att det behövs en stereotaktisk enhet. Vår metod kombinerar användandet av en guide skruv, för att exakt lokalisera den region av hjärnan mest lämplig för in vivo tumörutveckling och en automatiserad infusionspump som möjliggör samtidig ympning av upp till 10 djur i taget. Guiden skruv augmentation förfarande tar mindre än 5 minuter att utföra. Den automatiserade infusion av celler vid 30 l / tim tar bara 10 minuter för en 5 l volym. Detta säkerställer korrekt dosering med konstant hastighet och minskar risken för cellen utvisning i den extra-kraniala området på grund av ökat intrakraniellt tryck. Vi har också utfört den här proceduren med 10 l volym och har inte observerat några extra kraniella tumörtillväxt grund av cellulära reflux. Eftersom den automatiserade infusionspumpen tillåter också flera djur som skall inokuleras samtidigt att vi kan injicera upp till 60 djur per timme jämfört med en stereotaktisk förfarande som är begränsad till cirka 15 djur per timme.
Det mest kritiska steget i detta förfarande är platsen för vägledning skruven i skallen som sin position bestämmer den ultimata platsen för tumören bulk. Om guiden skruven är för centralt, kommer cellerna injiceras i en region mellan de två hjärnhalvorna medan om guiden är placerad för långt fram, kommer cellerna inte injiceras in i hjärnan alls. Det är därför viktigt att vara så noggranna som möjligt att hitta guiden 2,5 mm i sidled och 1 mm främre till bregma 1. I denna studie använde vi en skruv av stål guide, även plast styrskruvarna finns också för de studier som kräver hjärnan såsom MR eller PET 6. Även om den automatiska infusionspumpen är kostnadseffektivt oöverkomliga för vissa grupper, kan cellerna fortfarande injiceras manuellt snabbare än stereotaktisk strategier. Sammantaget kan detta snabbt, korrekt och reproducerbar metod användas för att studera gliom, medulloblastom och hjärntumörer stam 7. Detta förfarande har utförts på över 500 möss mellan våra två laboratorier med dödsfall på grund av oväntade bedövning reaktioner (<1%). Möss som var bultade med guiden skruv och därefter infunderas med celler inte dör eller drabbas av någon neurologiska komplikationer som en följd av förfarandet. Djur har överlevt senaste 100 dagarna utan några komplikationer. Även om vi föredrog att använda en hårlös mus, ett nedsatt immunförsvar mus med hår som SCID skulle vara lika lämpliga, förutsatt att skallen håret togs bort före det kirurgiska ingreppet för att hålla platsen ren och för att förhindra håret att störa guide skruv.
Det finns flera nya behandlingar närvarande utvecklas för behandling av gliom 8-10. Nyligen visade vi att subkutan U87MG gliom xenografter kan hämmas genom behandling med AMG102 3, en humaniserad antikropp riktad mot HGF genomgår för närvarande klinisk utvärdering i gliom 5. Vi använde metoden beskrivs här för att skapa intrakraniella U87MG tumörer i hjärnan hos nakna möss. Vår studie visar tydligt nyttan av metoden och visar att AMG102 avsevärt hämmar tillväxten av orthotopic U87MG implanterad. Vi kommer att fortsätta att använda denna modell för att bestämma vilka andra läkemedel kan användas i kombination med AMG102 för att få mer effektiv hämning av tumörtillväxt.
The authors have nothing to disclose.
Författarna vill tacka Verlene Henry och Lindsay Holmes för att få hjälp att utveckla denna modell. Detta arbete har delvis finansierats av James S. McDonnell Foundation (# 220.020.173).
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
---|---|---|---|
DMEM/F12 | Invitrogen | 12634010 | |
FCS | Bovogen | SFBS | |
Trypsin | Invitrogen | 15050065 | |
EDTA | Sigma | E6758 | |
Balb/c nu/nu mice | ARC Perth | ||
Screw Holder | Plastics One | SD-1 | |
Drill Holder | Plastics One | DH-1 | |
Drill Bit | Plastics One | D#60 | |
Screw guide (metal) | Plastics One | C212SG | |
Screw Dummy (stylus) | Plastics One | C212SD | |
Hamilton Syringe (10 μl 26g cemented needle) | Grace Division Discovery Science | 80075 | |
PHD 22/2000 infusion pump | Harvard Apparatus | 70-2003 | Optional |
Vetbond | 3M | 1469SB | |
Thermo pad | Harvard Apparatus | 340390 |