Summary
Afin d'évaluer de nouveaux paradigmes thérapeutiques pour le traitement du gliome, physiologiques des modèles pertinents sont essentiels. Nous utilisons une procédure de guider implantable à vis pour l'établissement des modèles de xénogreffe intracrânienne qui est plus rapide et plus sûr que les approches stéréotaxique.
Abstract
Le greffage de cellules tumorales humaines dans le cerveau des souris immunodéprimées est une méthode établie pour l'étude des cancers du cerveau, notamment le glioblastome (gliome) et médulloblastome. L'approche stéréotaxique largement utilisée ne permet pour l'injection d'un seul animal à la fois, beaucoup de travail et nécessite un équipement hautement spécialisé. La méthode vis de guide, initialement développé par Lal et al., 1 a été développé pour éliminer les procédures stéréotaxiques encombrant. Nous allons maintenant décrire une approche Guide modifiés vis qui est rapide et exceptionnellement sûr; qui sont tous deux essentiels des considérations éthiques. Notamment, notre procédure intègre désormais une pompe à perfusion qui permet jusqu'à 10 animaux destinés à être injectés simultanément avec des cellules tumorales.
Pour démontrer l'utilité de cette procédure, nous avons établi des cellules de gliome humain U87MG que les xénogreffes intracrânienne chez la souris, qui ont ensuite été traitées avec AMG102; un anticorps entièrement humain dirigé vers HGF / facteur de dispersion actuellement l'objet d'une évaluation clinique 2-5. Injection systémique de AMG102 significativement prolongé la survie de toutes les souris avec des xénogreffes U87MG intracrânienne et a abouti à un certain nombre de guérisons complètes.
Cette étude démontre que la méthode vis de guide est un peu coûteux, l'approche hautement reproductible pour l'établissement de xénogreffes intracrânienne. Par ailleurs, il fournit un modèle pertinent physiologiques pour valider de nouvelles stratégies thérapeutiques pour le traitement des cancers du cerveau.
Protocol
1. Les lignées cellulaires
- U87MG cellules de gliome sont cultivées dans de grands flacons de culture tissulaire avec du DMEM-F12 supplémenté avec 5% de sérum de veau fœtal (FBS).
- Les cellules sont récoltées par les flacons de lavage à deux reprises avec du phosphate chaude saline tamponnée (PBS) et les incuber à 37 ° C pendant 5 minutes avec 10 ml de PBS contenant 0,25% de trypsine et 0,05% d'EDTA. Une fois que les cellules sont levées, elles sont placées dans un tube de 50 ml contenant 10 ml de milieux de culture et centrifugés (300 X g pendant 4 min).
- Après le lavage, les cellules sont resuspendues à une concentration de 10 x 10 6 / ml dans les milieux de culture, ce qui a permis pour un ensemencement de 50.000 cellules / 5 pl.
- Les cellules sont conservées dans la glace jusqu'à l'injection intracrânienne.
2. Guide à vis intracrânienne boulonnage
Cette procédure peut être effectuée plusieurs jours avant l'injection des cellules. Toutes les procédures décrites ici ont été réalisées dans le cadre stricte des conditions stériles.
- Souris (BALB / c nu / nu féminin; 5-6 semaines, environ 18g) sont numérotées à des fins d'identification, pesés et anesthésiés avec un intrapéritonéale (IP) par injection d'un mélange de kétamine (100 mg / kg) et de xylazine (5 mg / kg).
- La peau est essuyé avec une solution d'iode et d'une petite incision (2-3 mm) se fait le long du côté droit de la ligne médiane et antérieure à la ligne interaural. Cette situation expose les points de suture coronale et sagittale du crâne. Le bregma est positionné à la jonction de ces deux points de suture.
- Le point d'entrée Guide vis est ensuite marqué à un point de 2,5 mm latéral et 1 mm antérieure au bregma. Ce point est situé directement au-dessus du noyau caudé 1.
- Un trou de 1 x 1 mm de profondeur est percé avec une main stériles maintenues foret à travers le crâne de la mère.
- Une vis de guidage stérilisés qui s'étendra de 1,6 mm sous la surface des crânes dans la dure-mère est ensuite boulonné dans le trou avec un tournevis jusqu'à ce ras du crâne (figure 1A).
- Un stylet stérile ou factices vis est ensuite placé dans le trou central de la vis de guide pour fermer l'ouverture (figure 1B).
- La plaie est fermée avec une colle tissulaire Vetbond (n-butyl cyanoacrylate) et les souris reçoivent une injection intrapéritonéale de reversine (petits animaux) (0,1 ml / kg) et carprofène (5 mg/kg/100 ul) pour l'analgésie. Les souris sont ensuite autorisés à récupérer sur un tapis de réchauffement (36 ° C) qui peut prendre jusqu'à 20 minutes. Les souris sont fréquemment suivis et observés pendant ce temps de récupération jusqu'à ce qu'ils soient pleinement conscients.
3. Intracrânienne greffe cellulaire
- Une seringue stérile menottées Hamilton est préparé en appliquant un petit anneau en plastique à la pointe de l'aiguille permettant seulement 2 mm de l'aiguille de prolonger en dessous de la sortie de la vis de guidage (figure 1B). Le point d'inoculation final est donc de 3,5 mm en dessous de la surface du crâne.
- Quatre jours après la chirurgie vis de guidage, les souris sont à nouveau anesthésiés comme ci-dessus (2,1) et une petite incision est faite sur la vis de guidage pour retirer le stylet.
- La seringue menottées Hamilton est ensuite rempli avec 5 pi de bien prendre cellules mixtes précautions pour ne pas créer ou établir les bulles d'air.
- La seringue est fixé à la pompe de perfusion et de l'aiguille est insérée dans la vis de guidage (figure 1C). Les cellules sont ensuite infusé à un taux de 30 ul par heure.
- L'appareil automatisé (figure 1D) nous a permis d'injecter jusqu'à 10 animaux en même temps à un débit constant. Les cellules peuvent également être injectés manuellement en utilisant la seringue Hamilton menottées ou bien la seringue peut être menotté par une pointe de pipette 200 ul qui a été coupé par 3 mm pour permettre à la pointe de l'aiguille au-delà de la vis de guidage par 2 mm. L'injection doit alors être effectuée à un rythme constant stable.
- Lorsque la perfusion est terminée, la seringue est soigneusement enlevé et le stylet est remplacé dans la vis guide. La plaie est fermée collés et les souris sont donnés des médicaments de récupération comme avant (2,7) et a permis de récupérer sur un tapis de réchauffement.
4. Défi thérapeutique
- Quatre jours après l'inoculation des cellules U87MG, les souris sont pesés et divisés au hasard en groupes de contrôle et de traitement.
- Le groupe de contrôle est donné une intra-péritonéale (IP) d'injection de PBS (100 pl), tandis que le groupe de traitement est donné une injection IP de AMG102 (100 ug dans 100 ul de PBS).
- Les injections sont répétées tous les deux jours pendant 14 jours, un total de 6 injections (figure 2).
- Après la dernière injection, les souris sont contrôlés quotidiennement et pesé tous les deux jours.
- Lorsque les souris ont commencé à afficher significative des dysfonctionnements neurologiques (troubles de l'équilibre, paralysie), la déshydratation, ou perte de poids de plus de 10% ou moribonds, ils étaient humainement euthanasiés. Ces humaine point final jours ont ensuite été enregistrées sur la courbe de survie de Kaplan-Meier.
5. Evaluation de l'efficacité thérapeutique
6. Les résultats représentatifs:
Les animaux témoins ont commencé à montrer des signes de troubles neurologiques et la perte de poids 23 jours après l'inoculation initiale des cellules. Cela a été considérablement retardé dans le groupe traité AMG102 à 35 jours. En effet en 35 jours, 77% (n = 7 / 9) du groupe de contrôle avaient été euthanasiés. La courbe de survie de Kaplan-Meier démontre clairement l'augmentation significative de la survie en réponse à AMG102 traitement (figure 3). En 70 jours, 88% des souris témoins ont été euthanasiés (n = 8 / 9), comparativement à 37% (n = 3 / 8) des AMG102 groupe traité. L'analyse histologique des cerveaux a confirmé que tous les 9 animaux du groupe contrôle ont développé des tumeurs, comparativement à seulement 3 des 8 AMG102 souris traitées (figure 4).
Figure 1: Image (A) montre vis de guidage intracrânienne positionné dans une zone située directement au-dessus du noyau caudé. Le revers seringue Hamilton (pré-chargé avec des cellules) est alors placé à l'intérieur de la vis guider afin que l'aiguille de 2 mm d's'étend au-delà du guide et les cellules sont injectées de 3,5 mm à l'intérieur du noyau caudé. La seringue est ensuite retiré et remplacé par un stylet (B). Le dispositif de perfusion automatique (C) peut injecter jusqu'à 10 animaux à la fois. On voit ici cinq injections simultanées (D).
Figure 2: Schéma du protocole de l'étude. Les cellules ont été injectées au jour 0 avec un traitement à compter du jour 4. Les animaux témoins ont reçu une injection de PBS (100 pl) IP alors que le groupe de traitement ont reçu une injection de AMG102 (100 ug/100 ul) IP. Ces injections ont été réalisées tous les deux jours pendant 10 jours. Un total de 6 injections ont été administrées. Les animaux ont ensuite suivis pendant 70 jours des signes de troubles neurologiques et physiques.
Figure 3: courbe de survie de Kaplan-Meier comparant le contrôle et AMG102 souris traitées. Significative de la survie a été obtenue après un traitement par AMG102 (p = 0,005).
Figure 4: microphotographies de coupes de cerveau coronale montrant le développement de tumeurs chez les animaux témoins (A) et pas de développement de tumeurs cérébrales dans le AMG102 animaux traités (B). La barre d'échelle est de 1 mm.
Discussion
La méthode Guide intracrânienne vis présentée ici permet la création rapide et reproductible des xénogreffes intracrânienne et dans les mains d'un technicien animalier qualifié, cette procédure est très facile à réaliser sans la nécessité d'un dispositif de stéréotaxie. Notre méthode combine l'utilisation d'une vis de guide, de localiser avec précision la région du cerveau la plus appropriée pour le développement tumoral in vivo, et une pompe à perfusion automatisée qui permet de l'inoculation simultanée d'un maximum de 10 animaux à la fois. La procédure d'augmentation guide-vis prend moins de 5 minutes à effectuer. La perfusion automatisée des cellules à 30 pl / heure prend seulement 10 minutes pour un volume de 5 pl. Ceci assure un dosage précis à un taux constant et réduit le risque d'expulsion de cellules dans la zone extra-crânienne due à la pression intracrânienne accrue. Nous avons également effectué cette procédure avec 10 volumes ul et n'ont observé aucun croissance tumorale extra-crâniennes dues au reflux cellulaire. Comme la pompe à perfusion automatisée permet aussi plusieurs animaux à inoculer simultanément, nous pouvons injecter jusqu'à 60 animaux par heure, comparativement à une procédure stéréotaxique qui est limitée à environ 15 animaux par heure.
L'étape la plus critique dans cette procédure est l'emplacement des vis de guidage dans le crâne que sa position détermine l'emplacement final du volume de la tumeur. Si la vis guide est trop centrale, les cellules vont être injectés dans une région entre les deux hémisphères du cerveau alors que si le guide est placé au loin vers l'avant, les cellules ne sera pas injecté dans le cerveau du tout. Il est donc essentiel d'être aussi précis que possible de localiser le guide latéral et 2,5 mm à 1 mm en avant de la bregma 1. Dans cette étude nous avons utilisé une vis de guidage en acier, bien que les vis de guidage en plastique sont également disponibles pour ceux qui nécessitent des études d'imagerie cérébrale comme l'IRM ou PET 6. Même si la pompe à perfusion automatisée est un coût prohibitif pour certains groupes, les cellules peuvent encore être injectés manuellement plus rapidement que les approches de stéréotaxie. Globalement, cette méthode rapide, précise et reproductible peut être utilisée pour étudier le gliome, médulloblastome et les tumeurs du tronc cérébral 7. Cette procédure a été effectuée sur plus de 500 souris entre nos deux laboratoires avec les décès dus à des réactions inattendues anesthésie (<1%). Les souris qui ont été boulonnés avec la vis de guide et ensuite infusé avec des cellules n'ont pas mourir ou de souffrir de complications neurologiques à la suite de la procédure. Les animaux ont survécu passé 100 jours sans aucune complication. Bien que nous avons préféré utiliser une souris sans poils, une souris immuno-compromis avec les cheveux comme le SCID serait tout aussi approprié fourni les cheveux du crâne a été retiré avant la chirurgie pour garder le site propre et pour empêcher les cheveux interférer avec vis de guidage.
Il ya plusieurs nouveaux traitements actuellement développé pour le traitement du gliome 8-10. Récemment, nous avons montré que sous-cutanée U87MG xénogreffes de gliome peut être inhibée par un traitement avec AMG102 3; un anticorps humanisé dirigé vers HGF actuellement en cours d'évaluation clinique dans les gliomes 5. Nous avons utilisé la méthode de décrire ici d'établir des tumeurs intracrâniennes U87MG dans le cerveau des souris nude. Notre étude montre clairement l'utilité de la méthode et démontre que AMG102 inhibe significativement la croissance de xénogreffes de U87MG orthotopique. Nous allons continuer à utiliser ce modèle pour déterminer quelles autres thérapeutiques peuvent être utilisées en combinaison avec AMG102 d'obtenir une inhibition plus efficace de la croissance tumorale.
Disclosures
Ce travail a été soutenu par une subvention de recherche d'Amgen Inc
Acknowledgments
Les auteurs tiennent à remercier Verlene Henry et Lindsay Holmes pour l'aide au développement de ce modèle. Ce travail a été partiellement financé par la Fondation James S. McDonnell (# 220020173).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM/F12 | Invitrogen | 12634010 | |
| FCS | Bovogen | SFBS | |
| Trypsin | Invitrogen | 15050065 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E6758 | |
| Balb/c nu/nu mice | ARC Perth | ||
| Screw Holder | Plastics One | SD-1 | |
| Drill Holder | Plastics One | DH-1 | |
| Drill Bit | Plastics One | D#60 | |
| Screw guide (metal) | Plastics One | C212SG | |
| Screw Dummy (stylus) | Plastics One | C212SD | |
| Hamilton Syringe (10 μl 26g cemented needle) | Grace Division Discovery Science | 80075 | |
| PHD 22/2000 infusion pump | Harvard Apparatus | 70-2003 | Optional |
| Vetbond | 3M | 1469SB | |
| Thermo pad | Harvard Apparatus | 340390 |
References
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