Summary
Um neue therapeutische Paradigmen für die Behandlung von Gliomen zu bewerten, sind physiologisch relevanten Modelle unerlässlich. Wir nutzen einen implantierbaren Führungsschraube Verfahren für die Einrichtung von intrakraniellen Xenograft-Modelle, schneller und sicherer als stereotaktische Ansätze ist.
Abstract
Die Transplantation von menschlichen Tumorzellen in das Gehirn von immunsupprimierten Mäusen ist eine etablierte Methode für die Untersuchung von Hirntumoren einschließlich Glioblastom (Gliom) und Medulloblastom. Die weit verbreitete stereotaktische Ansatz erlaubt nur für die Injektion von einem einzigen Tier zu einem Zeitpunkt, ist arbeitsintensiv und erfordert hochspezialisierte Geräte. Die Führungsschraube Methode, die ursprünglich von Lal et al., 1 entwickelt wurde entwickelt, um lästige stereotaktische Verfahren zu beseitigen. Wir beschreiben nun eine modifizierte Führungsschraube Ansatz, der eine schnelle und besonders sicher ist, welche beide kritische ethische Überlegungen. Bemerkenswert ist, unser Verfahren beinhaltet nun eine Infusionspumpe mit bis zu 10 Tiere gleichzeitig mit Tumorzellen injiziert werden.
Zur Demonstration der Nützlichkeit dieses Verfahrens haben wir Menschen U87MG Gliomzellen als intrakranielle Xenotransplantate in Mäusen, die dann mit AMG102 behandelt wurden, ein vollständig humaner Antikörper, der zur HGF / Scatter-Faktor derzeit in der klinischen Evaluation 2-5. Systemische Injektion von AMG102 signifikant das Überleben von allen Mäusen mit intrakraniellen U87MG Xenotransplantate verlängert und führte zu einer Reihe von kompletten Heilung.
Diese Studie zeigt, dass die Führungsschraube Methode ein kostengünstiges, hoch reproduzierbare Konzept für die Erarbeitung intrakraniellen Xenotransplantate ist. Darüber hinaus bietet es eine relevante physiologische Modell zur Validierung neuer therapeutischer Strategien zur Behandlung von Hirntumoren.
Protocol
1. Zell-Linien
- U87MG Gliom-Zellen sind in großen Zellkulturflaschen mit DMEM-F12 mit 5% fötalem Rinderserum (FBS) kultiviert.
- Die Zellen werden durch Waschflaschen zweimal mit warmem Phosphate geerntet Buffered Saline (PBS) und Inkubation bei 37 ° C für 5 Minuten mit 10 ml PBS mit 0,25% Trypsin und 0,05% EDTA. Sobald Zellen sind aufgehoben, sie in eine 50 ml Tube mit 10 ml von Kulturmedien und zentrifugiert (300 X g für 4 min) platziert werden.
- Nach dem Waschen werden die Zellen bei einer Konzentration von 10 resuspendiert x 10 6 / ml in Kulturmedien, die für eine Impfung von 50.000 Zellen / 5 ul erlaubt.
- Die Zellen werden auf Eis, bis intrakranieller Injektion gehalten.
2. Führungsschraube intrakraniellen Verschraubung
Dieses Verfahren kann durchgeführt werden einige Tage vor der Injektion von Zellen. Alle hier beschriebenen Verfahren wurden unter streng sterilen Bedingungen durchgeführt.
- Mäuse (BALB / c nu / nu weiblich, 5-6 Wochen, ca. 18g) sind zum Zwecke der Identifizierung nummeriert, gewogen und anästhesiert mit einer intraperitonealen (ip) Injektion einer Mischung von Ketamin (100 mg / kg) und Xylazin (5 mg / kg).
- Die Haut ist nach unten mit einer Jodlösung abgewischt und einen kleinen Schnitt (2-3 mm) ist auf der rechten Seite der Mittellinie und vor dem interauralen Linie gemacht. Dies macht die koronaren und sagittalen Naht des Schädels. Die Bregma liegt an der Kreuzung der beiden Nähte positioniert.
- Die Führungsschraube Einstiegspunkt wird dann an einem Punkt, 2,5 mm lateral und 1 mm anterior der Bregma markiert. Dieser Punkt befindet sich direkt oberhalb des Nucleus caudatus 1 befindet.
- Ein 1 x 1 mm tiefes Loch wird mit einer sterilen Hand Spiralbohrer durch den Schädel an die Dura gebohrt.
- Ein sterilisiert Führungsschraube, dass 1,6 mm unter der Oberfläche Schädel in die dura verlängern wird dann in das Loch mit einem Schraubendreher verschraubt, bis sie bündig mit dem Schädel (Abbildung 1A).
- Eine sterile Stilett oder Schraube Dummy wird dann in die zentrale Bohrung der Führungsschraube platziert, um die Öffnung (Abbildung 1B) zu schließen.
- Die Wunde wird mit Vetbond Gewebekleber (n-Butyl-Cyanoacrylat) und die Mäuse sind geschlossen eine intraperitoneale Injektion von Reversin (kleine Tiere) (0,1 ml / kg) und Carprofen (5 mg/kg/100 ul) zur Analgesie gegeben. Mäuse sind dann erlaubt, auf eine Erwärmung Matte (36 ° C), welche bis zu 20 Minuten zu erholen. Mäuse sind häufig kontrolliert und beobachtet während dieser Erholungszeit, bis sie bei vollem Bewusstsein sind.
3. Intrakranielle zellulären Transplantation
- Eine sterile gefesselt Hamilton-Spritze wird durch Anlegen eines kleinen Kunststoffring an der Nadelspitze so dass nur 2 mm von der Nadel unter die Führungsschraube Steckdose (Abbildung 1B) erweitern vorbereitet. Die letzte Impfung Punkt ist also 3,5 mm unterhalb der Kopfoberfläche.
- Vier Tage nach der Führungsschraube Chirurgie, werden die Mäuse wieder betäubt wie oben (2,1) und einen kleinen Schnitt wird über die Führungsschraube gemacht, um das Stilett zu entfernen.
- Die Handschellen Hamilton Spritze wird dann mit 5 ul gut gemischt Zellen unter vorsichtshalber nicht zu erstellen oder erstellen Luftblasen gefüllt.
- Die Spritze wird die Perfusionspumpe gesichert und die Nadel in die Führungsschraube (Abbildung 1C) eingesetzt. Die Zellen werden dann mit einer Rate von 30 ul pro Stunde infundiert.
- Die automatisierte Vorrichtung (Abbildung 1D) erlaubt es uns, spritzen bis zu 10 Tieren in einer Zeit auf einem konstanten Durchfluss. Zellen können auch manuell mit dem gefesselten Hamilton-Spritze injiziert werden oder alternativ die Spritze kann Handschellen durch einen 200 ul Pipettenspitze, die von 3 mm wurde beschnitten, damit die Nadelspitze, über die Führungsschraube von 2 mm zu erweitern. Die Injektion muss dann mit einer konstanten gleichmäßigen Tempo durchgeführt werden.
- Wenn Infusion abgeschlossen ist, wird die Spritze vorsichtig entfernt und das Stilett in die Führungsschraube ersetzt. Die Wunde wird verklebt geschlossen und die Mäuse sind Erholung Medikamente wie zuvor (2,7) gegeben und man ließ sie auf einer Erwärmung Matte zu erholen.
4. Therapeutische Herausforderung
- Vier Tage nach dem U87MG Zellinokulation sind Mäuse gewogen und nach dem Zufallsprinzip in Kontroll-und Behandlungsgruppen aufgeteilt.
- Die Kontrollgruppe ist eine intraperitoneale (ip) Injektion von PBS (100 ul) gegeben, während der Behandlungsgruppe eine IP-Injektion von AMG102 (100 ug in 100 ul PBS) gegeben ist.
- Die Injektionen werden wiederholt jeden zweiten Tag für 14 Tage, insgesamt 6 Injektionen (Abbildung 2).
- Nach der letzten Injektion werden die Mäuse täglich überwacht und wog jeden zweiten Tag.
- Wenn Mäuse zu erheblichen neurologischen Störungen (Saldo Störungen, Lähmungen), Dehydrierung, oder mehr als 10% Gewichtsverlust oder sterbender Display begann, waren sie human eingeschläfert. Diese humane Endpunkt Tage waren dann auf der Kaplan-Meier-Überlebensrate Kurve aufgezeichnet.
5. Evaluation der therapeutischen Effizienz
6. Repräsentative Ergebnisse:
Kontrolltiere begann Anzeichen von neurologischen Störungen und Gewichtsverlust 23 Tage nach der ersten Impfung von Zellen zeigen. Dies wurde deutlich in der AMG102 behandelten Gruppe um 35 Tage verzögert. In der Tat für Tag 35, 77% (n = 9.7) in der Kontrollgruppe waren eingeschläfert. Die Kaplan-Meier-Überlebensrate Kurve zeigt deutlich den signifikanten Anstieg im Überleben in Reaktion auf AMG102 Behandlung (Abbildung 3). Am Tag 70, hatten 88% der Kontroll-Mäusen eingeschläfert (n = 9.8) im Vergleich zu 37% (n = 8.3) von AMG102 behandelten Gruppe. Histologische Analyse der Gehirne bestätigt, dass alle 9 Tiere in der Kontrollgruppe entwickelten Tumoren nur 3 der 8 AMG102 behandelten Mäusen (Abbildung 4).
Abbildung 1: Bild (A) zeigt intrakraniellen Führungsschraube in einem Bereich unmittelbar oberhalb des Nucleus caudatus liegt positioniert. Die Handschellen Hamilton-Spritze (mit Zellen vorinstalliert) wird dann in der Führungsschraube platziert, so dass 2 mm der Nadel erstreckt sich über die Führung und die Zellen sind 3,5 mm innerhalb des Nucleus caudatus injiziert. Die Spritze wird später entfernt und durch ein Stilett (B) ersetzt. Die automatische Infusionsvorrichtung (C) injizieren können bis zu 10 Tiere auf einmal. Dargestellt sind fünf gleichzeitige Injektionen (D).
Abbildung 2: Schematische Darstellung des Studienprotokolls. Die Zellen wurden am Tag 0 mit der Behandlung beginnen am Tag 4 injiziert. Kontrolltiere erhielten eine Injektion von PBS (100 ul) IP während der Behandlung erhielten eine Injektion von AMG102 (100 g/100 ul) IP. Diese Injektionen wurden jeden zweiten Tag für 10 Tage. Es wurden insgesamt 6 Injektionen gegeben wurden. Die Tiere wurden dann für 70 Tage auf Anzeichen von neurologischen und körperlichen Störungen überwacht.
Abbildung 3: Kaplan-Meier Überlebenskurven verglichen Steuerung und AMG102 behandelten Mäuse. Signifikanten Überlebensvorteil war nach der Behandlung mit AMG102 (p = 0,005) erzielt.
Abbildung 4: Mikrophotographien von koronalen Hirnschnitten demonstrieren Tumorentwicklung in den Kontroll-Tieren (A) und kein Gehirntumor Entwicklung in den AMG102 behandelten Tieren (B). Maßstabsbalken ist 1 mm.
Discussion
Die intrakranielle Führungsschraube hier vorgestellte Methode ermöglicht die schnelle und reproduzierbare Etablierung von intrakraniellen Xenotransplantate und in die Hände eines ausgebildeten Tier-Techniker, dieses Verfahren ist sehr einfach und ohne die Notwendigkeit eines stereotaktischen Gerät durchgeführt. Unsere Methode kombiniert die Verwendung einer Führungsschraube, um genau zu lokalisieren die Region des Gehirns am besten geeignet für in vivo Tumor-Entwicklung und eine automatisierte Infusionspumpe, die für die gleichzeitige Impfung von bis zu 10 Tiere auf einmal erlaubt. Die Führungsschraube Augmentation dauert weniger als 5 Minuten in Anspruch. Die automatisierte Infusion von Zellen bei 30 ul / h dauert nur 10 Minuten für eine 5 ul Volumen. Dies gewährleistet eine genaue Dosierung mit einer konstanten Rate und reduziert das Risiko der Zell-Ausstoß in die extrakraniellen Bereich aufgrund der erhöhten Hirndruck. Wir haben auch dieses Verfahren mit 10 ul durchgeführt und haben keine extra-kraniale Tumorwachstum durch zelluläre Rückfluss beobachtet. Da die automatisierten Infusionspumpe ermöglicht auch mehrere Tiere gleichzeitig geimpft werden wir spritzen bis zu 60 Tiere pro Stunde im Vergleich zu einem stereotaktischen Verfahren, das zu etwa 15 Tieren pro Stunde begrenzt ist.
Der wichtigste Schritt in diesem Verfahren ist die Lage des Führungsschraube in den Schädel als seine Position bestimmt der ultimative Ort der Tumormasse. Wenn die Führungsschraube ist zu zentral, die Zellen in einem Bereich zwischen den beiden Hirnhälften während, wenn die Führung zu weit nach vorne gebracht wird injiziert werden, werden die Zellen nicht in das Gehirn überhaupt injiziert werden. Es ist daher wichtig, so genau wie möglich bei der Suche nach der Führung 2,5 mm lateral und 1 mm anterior der Bregma 1. In dieser Studie verwendeten wir einen Stahl Führungsschraube, obwohl aus Kunststoff Führungsschrauben auch für diejenigen Studien, die Bildgebung des Gehirns, wie MRT oder PET 6 erfordern. Auch wenn die automatisierte Infusionspumpe ist unerschwinglich für einige Gruppen, können die Zellen noch manuell schneller als stereotaktische Ansätze injiziert werden. Insgesamt kann diese schnelle, genaue und reproduzierbare Methode zur Gliom, Medulloblastom und Hirnstamm Tumoren 7 zu studieren. Dieses Verfahren hat bereits über 500 Mäusen zwischen unseren beiden Labors mit Todesfällen aufgrund von unerwarteten Narkose Reaktionen (<1%) durchgeführt. Mäuse, die mit der Führung Schraube verschraubt wurden und anschließend infundiert mit Zellen nicht starben oder leiden alle neurologischen Komplikationen als Folge des Verfahrens. Tiere haben seit 100 Tagen ohne Komplikationen überstanden. Obwohl wir zu einer haarlosen Maus, einem immungeschwächten Maus mit Haaren wie die SCID verwenden bevorzugt wäre ebenso angemessen, sofern die Schädel Haar vor war es, die operativ entfernt, damit die Stelle sauber und die Haare stören Führungsschraube verhindern.
Es gibt mehrere neuartige Therapeutika derzeit für die Behandlung von Gliomen 8-10 entwickelt. Kürzlich haben wir gezeigt, dass die subkutane U87MG Gliom Xenotransplantate durch Behandlung mit AMG102 3 kann verhindert werden, ein humanisierter Antikörper, der zur HGF derzeit in der klinischen Evaluierung in Gliom 5. Wir verwendeten die Methode hier beschreiben, intrakranielle U87MG Tumoren im Gehirn von Nacktmäusen zu etablieren. Unsere Studie zeigt deutlich den Nutzen der Methode und zeigt, dass AMG102 deutlich hemmt das Wachstum von orthotopen U87MG Xenotransplantate. Wir werden auch weiterhin dieses Modell verwenden, um festzustellen, was andere Therapeutika in Kombination mit AMG102 verwendet werden, um effektivere Hemmung des Tumorwachstums zu erhalten.
Disclosures
Diese Arbeit wurde durch ein Forschungsstipendium von Amgen Inc. unterstützt
Acknowledgments
Die Autoren bedanken sich bei Verlene Henry und Lindsay Holmes um Hilfe danke in der Entwicklung dieses Modells. Diese Arbeit wurde teilweise durch die James S. McDonnell Foundation (# 220020173) finanziert.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM/F12 | Invitrogen | 12634010 | |
| FCS | Bovogen | SFBS | |
| Trypsin | Invitrogen | 15050065 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E6758 | |
| Balb/c nu/nu mice | ARC Perth | ||
| Screw Holder | Plastics One | SD-1 | |
| Drill Holder | Plastics One | DH-1 | |
| Drill Bit | Plastics One | D#60 | |
| Screw guide (metal) | Plastics One | C212SG | |
| Screw Dummy (stylus) | Plastics One | C212SD | |
| Hamilton Syringe (10 μl 26g cemented needle) | Grace Division Discovery Science | 80075 | |
| PHD 22/2000 infusion pump | Harvard Apparatus | 70-2003 | Optional |
| Vetbond | 3M | 1469SB | |
| Thermo pad | Harvard Apparatus | 340390 |
References
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