Summary
ووصف واضح وطريقة موحدة للتشريح والعزلة من القلب الزرد في مراحل تنموية متعددة. وتناقش أيضا الشرح وتقدير التقنيات.
Abstract
الزرد أصبحت كائن نموذج مفيد وعملي لدراسة القلب الجنينية للتنمية (انظر استعراض الاخيرة 1-6) ، ومع ذلك ، عمل فحص ما بعد الجنينية من خلال التنمية الكبار القلب كان محدودا 70-10. دراسة مورفولوجية المتغيرة للقلب النضج والشيخوخة هي مقيدة بسبب عدم وجود التقنيات المتاحة لتنظيم وعزل قلوب الأحداث والبالغين. من أجل تحليل التنمية على مدى عمر قلب السمكة ، ونحن تشريح قلوب الزرد في مراحل عديدة ومنها صورة لمزيد من التحليل 11. يمكن للميزات المورفولوجية للقلب بسهولة يمكن قياسها كميا ، ويمكن قلوب الفردية لمزيد من التحليل من قبل مجموعة من الأساليب القياسية. الزرد تنمو بنسب متفاوتة والنضج يرتبط على نحو أفضل مع حجم الأسماك من العمر ، وهكذا ، بعد التثبيت ، والأسماك ، وصورة قياس طول نحن كمقياس لنضوج الأسماك. هذا البروتوكول يفسر اثنين ، حجم تقنيات متميزة تعتمد على تشريح الزرد ، بدءا من طول اليرقات معيار 3.5mm (SL) مع قلوب طول البطين 100μm (VL) ، بين الكبار ، مع SL من 30mm و1MM VL أو أكبر. اليرقات السمكية وتعليم الكبار وهيئة مميزة جدا والتشكل الجهاز. اليرقات ليست فقط أصغر بكثير ، لديهم أقل الصباغ وكل جهاز هو بصريا من الصعب جدا التعرف عليها. لهذا السبب ، فإننا نستخدم تقنيات تشريح متميزة.
كنا قبل التشريح ، تثبيت إجراءات ، كما اكتشفنا أن تشريح قلوب مباشرة بعد euthanization لها التشكل أكثر تنوعا ، مع بالون فضفاض للغاية ومثل الأذينين مقارنة مع قلوب إزالة التثبيت التالية. ثابت السمك قبل التشريح والاحتفاظ بها في التشكل فيفو وموقف الغرفة (لا تظهر البيانات). بالإضافة إلى ذلك ، لأغراض العرض التوضيحي ، ونحن نستفيد من القلب (عضلة القلب) محددة GFP تيراغرام المعدلة وراثيا (myl7 : GFP) twu34 (12) ، والذي يسمح لنا تصور قلب كامل ومفيد بشكل خاص في المراحل المبكرة في التنمية عندما القلب التشكل هو أقل وضوحا من الأنسجة المحيطة بها. تشريح القلب يجعل إجراء مزيد من التحليل للخلية وعلم الأحياء الجزيئية الكامنة وراء تطور ونضوج القلب باستخدام التهجين في الموقع ، المناعية ، واستخراج الحمض النووي الريبي أو الأساليب التحليلية الأخرى أسهل في مرحلة ما بعد الزرد الجنينية. وسوف يوفر هذا البروتوكول تقنية قيمة لدراسة التنمية نضوج القلب والشيخوخة.
Protocol
وأثيرت الزرد باستخدام البروتوكولات القياسية 13 في الحيوان كلية كوينز مرفق في 28 درجة مئوية. وينبغي بريفورميد أزواج الأسماك الفردية أو الجماعية والتزاوج الأجنة الناتجة تنظيفها وتخزينها في الحاضنة 28 درجة مئوية. ينبغي فحص صحة الأسماك يوميا. التسميد في آخر لمدة 5 أيام (DPF) ، ينبغي فصل الأسماك في خزانات في مناطق ذات كثافة الأسماك 10-15 ، ودخلت حيز الأسماك الحضانة المنشأة. للبروتوكول المعروضة هنا جمعت الزرد في اليرقة من خلال مراحل الكبار : 15 ، 30 ، 45 ، 60 ، 90 ، 180 DPF.
1. الزرد جمع الموضوع والتثبيت
- إزالة خزان الأسماك من الموائل به ووضعه في صافي Tricaine 0.2 ٪ إلى تخدير.
- مكان تخدير الأسماك في المياه الجليدية لمدة 15 دقيقة على الموت ببطء.
- جعل الطازجة بارافورمالدهيد 4 ٪ (PFA) في 1X الفوسفات مخزنة المالحة (PBS).
- احتضان الأسماك التي تم جمعها في PFA 4 ٪ لمدة 1-2 ساعات في الليل RT ثم في 4 درجات مئوية في طبق بتري ملفوفة في parafilm. هذا يحافظ على مسطح يجعل تشريح الأسماك وأسهل بكثير في وقت لاحق.
- بعد التثبيت ، وشطف مرتين في برنامج تلفزيوني مع توين (PBT). يمكن أن نضع في الأسماك PBT في 4 درجة مئوية لمدة تصل إلى 10 يوما.
2. تشريح الأسماك وقياس
- السمك مكان واحد في نصف طبق بتري مليئة PBS الطازجة وضعه على جنبه الايمن.
- قياس طول الأسماك من الخطم إلى قاعدة الذيل (والسويقة الذيلية) ، وليس بما زعانف الذيل ، وذلك باستخدام الفرجار الرقمية ملم (الشكل 1). هذا هو طول القياسية (SL).
- يمكن تعيين كل سمكة رقم / حرف تركيبة للسماح الأسماك الفردية والقلب الناتجة تشريح لتعقبها لتحليلها لاحقا. تم إدخال البيانات ، بما في ذلك عدد الأسهم الوالدين ، والعمر في التثبيت ، والقياسات SL ، إلى جدول ونظمت على أساس هذه التسميات.
- قبل التشريح ، والشرائط أنبوب التسمية PCR مع عدد تتبع تعيين وملء مع PBT أو حل مناسبة أخرى لمزيد من التحليل.
- توجيه الجانب البطني السمك في طبق بتري حتى حين استقرار الجسم مع ملقط يمسك رأسه بين العينين والخياشيم (الشكل 2).
الأسماك الصغيرة (أقل من 12mm SL) :
- أ) استخدام الملقط حادة ، أو إبرة صغيرة في حامل دبوس ، وإزالة العضلات الصدرية والزعانف من الجسم للكشف عن القلب. لا يمكن للحركة مستمرة من خلال ملقط تشريح قضية التيارات في PBT التي تحرك الأسماك. هذه هي مشكلة خاصة بالنسبة لصغار السمك ، وبالتالي يمكن استخدام إبرة صغيرة لإزالة العضلات الصدرية والزعانف وفتح تجويف الجسم.
- أ) استخدام ملقط برفق لحلج القطن في قلب من تجويف من تحت الأذين. بالتناوب ، في بعض الأسماك التي قد تكون قادرة على إزالة القلب عن طريق سحب بلطف خارج بصلي وبقية قلب ستتبع. كن حذرا من مكان الأذين إذا باستخدام هذه التقنية حيث يمكن بسهولة أن يكون معطوبا. إذا كان هناك الأنسجة الزائدة التي تأتي مع القلب ، والتي على ما يرام ، ويمكن بعد تطهيرها.
- أ) إذا كان السمك يحتوي على علامة فلوري القلب مثل تيراغرام (myl7 : GFP) twu34 ، واستخدام نطاق نيون للتشريح ، والتحقق من ازالة القلب من قبل الإزهار (الشكل 3).
- تتم إزالة أ) مرة واحدة في قلب من تجويف ، استخدم ملقط لعقد القلب وإبرة صغيرة لإزالة إضافية غير الأنسجة القلبية وبطانة epicardial من الخارج من القلب.
الأسماك الأكبر (أكبر من SL 12mm) :
- ب) عن طريق التعامل مع الربيع المقص الصغير ، وجعل ثلاثة شقوق أقل من 1MM العميق : 1 -- قطع عرضية من خلال الخياشيم 2 -- قطع عرضية في البطن الأمامي 3 -- خفض السهمي على الجانب البطني تربط كلا تخفيضات (الشكل 4).
- ب) استخدام الملقط حادة إزالة العضلات الصدرية والزعانف من الجسم لفتح تجويف الجسم وتكشف الأنسجة فضي للتأمور (الشكل 5A). إزالة هذه الأنسجة التامور والقلب سوف تصبح مرئية (الشكل 5B).
- ب) استخدام المقص الصغير لقطع الشريان المتصل الشريانية بصلي الشكل ، وتقع أعلى من القلب. بمجرد أن يتم قطع هذا الشريان ، وضعت تحت نصائح ملقط الأذين ، استخدم ملقط لحلج القطن في قلب من التجويف. إذا كان هناك الأنسجة الزائدة التي تأتي مع القلب ، والتي على ما يرام ، ويمكن إزالتها في وقت لاحق.
- ب) بمجرد إزالة القلب من تجويف ، استخدم ملقط سنتين إلى عقد القلب وإزالة الأنسجة الإضافية ، أو زوج واحد من ملقط لعقد القلب والإبرة الدقيقة لإزالة اضافية ، غير القلب الأنسجة. ويمكن إزالة بطانة epicardial ، يتضح من تصبغ به سوداء ، من الخارج من القلب إذا رغبت في ذلك عن طريق كشط بلطف الأنسجة.
3. التصوير القلوب
- يعد 23g / L المغذيات طبق بتري وأغار أغار تغطية طدت مع برنامج تلفزيوني.
- باستخدام الملقط ، وجعل جيدا في آغار الذي يسمح للراحة القلب في الاتجاه المطلوب للتصوير.
- Removه القلب من أنبوب من خلال عقد PCR غيض من بصلي مع ملقط بحزم. مكان القلب في طبق آغار.
- توجيه القلب في أجار إلى صورة فوتوغرافية. يمكن أن تكون العينة بعد استدارة كل صورة لجميع التوجهات المحتملة (الشكل 6).
- استخدام الضوء الحمل والتعرض لوقت قصير صورة قلوب. لإجراء تعديلات نوعية الضوء باستخدام التعرض عند الضرورة للحصول على أفضل صورة.
4. ممثل النتائج :
ويرد مثال جيد تشريح القلب نظيفة في توجهات متعددة في الشكل 6. وسوف يكون كل قلب بعض الاختلافات في التشكل العام ، ولكن القلب يجب أن يكون كاملا ، يحتوي على البطين سليمة ، والأذين الشريانية منتفخة. وترد بعض الأمثلة على هذا الاختلاف في التشكل العام في الشكل 7. ويمكن أيضا إزالة الأنسجة السوداء epicardial رصدت من القلب.
الشكل 1. قياس السمك من الخطم إلى السويقة الذيلية باستخدام الفرجار الرقمية ملم.
الشكل 2. امسك السمك مع ملقط بين العينين والخياشيم.
الشكل 3 ألف محددة الفلورسنت القلب علامة المعدلة وراثيا مثل تيراغرام (myl7 : GFP). twu34 يمكن ، كما هو موضح هنا ، والمعونة في تصور قلوب من تشريح الأسماك الصغيرة.
الشكل 4 ثلاثة شقوق لإزالة العضلات الصدرية والجلد : 1 -- قطع عرضية من خلال الخياشيم 2 -- قطع عرضية في البطن الأمامي 3 -- خفض السهمي على الجانب البطني ربط كل من التخفيضات.
. الشكل 5 رسائل الأسود تسمية غرف القلب : الشريانية بصلي (BA) ، البطين (الخامس) ، والأذين (أ).
A - تجويف الجسم العلوي مفتوحا لإظهار الأنسجة فضية من بيريكارديوم.
B - بعد إزالة بيريكارديوم ، والقلب هو مرئي وإزالتها بسهولة.
وتظهر الشكل 6. توجهات مختلفة من القلب. رسائل سوداء تسمية غرف القلب : الشريانية بصلي (BA) ، البطين (الخامس) ، والأذين (أ). السهام تشير غراي الموقع والتوجه للقلب ، في اشارة الى موقعه الطبيعي في الجسم : الأمامي (A) ، الخلفية (P) ، الظهرية (D) ، بطني (V) ، يسار (L) ، والحق (R). شريط يشير مقياس 400μm.
A - بطني نظرا للقلب
B - الظهرية نظرا للقلب
C - الوحشي وجهة نظر من الجانب الأيسر
D - الوحشي وجهة نظر من الجانب الأيمن
ويبين الشكل 7. مورفولوجية قلوب من مختلف الأحجام. رسائل سوداء تسمية غرف القلب : الشريانية بصلي (BA) ، البطين (الخامس) ، والأذين (أ). وأشار مقياس شريط 400 ميكرون.
AC - هارتس الأسماك النموذج مع SL أقل من 12mm
DF - هارتس الأسماك النموذج مع SL أكبر من 12mm
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
هذه الأساليب لتشريح القلب الزرد في مرحلة ما بعد جنينية الأسماك يسمح لإزالة كاملة من القلب التالفة. في حين أن هذا الأسلوب واضح ومباشر ، ويقدم أدلة لخفض الخارجية التي من شأنها منع إتلاف القلب ومطرد من ناحية لا بد لصغار السمك.
والخطوة الرئيسية خلال تشريح هو تحديد تأمور فضي كما القلب مباشرة داخل هذا الكيس. تصور بيريكارديوم يوفر علامة هامة لإيجاد وإزالة في نهاية المطاف على شكل قلب تجويف الجسم. كذلك ، فإن قطع الشريان متفوقة على الشريانية بصلي منع إزالة غير مقصودة من بصلي من بقية القلب. في جو من الأسماك يكون من الضروري أحيانا لإزالة الجزء السفلي من الجسم للحفاظ على الجسم والرأس العلوي الذي يحتوي على القلب مستقرة خلال التشريح. ويمكن القيام بذلك عن طريق الاستمرار في خفض قطع عرضية من خلال تجويف الجسم والعمود الفقري مع المقص.
تشريح القلب الزرد ليست فقط مفيدة لدراسات مماثلة لتحليلنا نضوج الخاصة ، ولكن قد تكون مفيدة في دراسة الحالات المرضية من الزرد ، RNA العزلة في القلب ، وغيرها من البحوث التحليلية التي تستخدم في القلب.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الإعلان عن أي تضارب في المصالح.
Acknowledgments
بفضل Birne ماري Tsiola Areti ، ويبدو أن أوريبي استيفيز Jaymie Arelys. وأيد هذا العمل في جزء من جامعة مدينة نيويورك ومؤسسة البحوث وهوارد هيوز الطبي الصيفي المنح لطلاب المعهد برنامج المرحلة الجامعية (المهماز) والمعهد الوطني للصحة RO3 41702-00-01. وأيد أيضا البحوث في كلية كوينز ، وأجريت بعض التجارب على معدات من مرفق الأساسية للتصوير ، البيولوجيا الخلوية والجزيئية في كلية كوينز.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Paraformaldehyde | EMD Millipore | PX0055 | .04g/mL in PBS |
| Forceps #55 | Fine Science Tools | 11295-51 | |
| Micro-scissors | Fine Science Tools | 15005-08 | |
| Pin holder | Fine Science Tools | 26016-12 | |
| Micro-needles | Fine Science Tools | 10130-10 | |
| Nutrient Agar | BBL | 11472 | 23g/L in distilled H2O |
| Petri dishes | BD Biosciences | 351029 | |
| PCR 8-tube strips | USA Scientific, Inc. | 1402-2500 | |
| Digital Caliper | Fisher Scientific | 14-648-17 |
References
- Ahmad, N., Long, S., Rebagliati, M. A southpaw joins the roster: the role of the zebrafish nodal-related gene southpaw in cardiac LR asymmetry. Trends Cardiovasc Med. 14, 43-49 (2004).
- Armstrong, E. J., Bischoff, J. Heart valve development: endothelial cell signaling and differentiation. Circ Res. 95, 459-470 (2004).
- Bakkers, J., Verhoeven, M. C., Abdelilah-Seyfried, S. Shaping the zebrafish heart: from left-right axis specification to epithelial tissue morphogenesis. Dev Biol. 330, 213-220 (2009).
- Glickman, N. S., Yelon, D. Cardiac development in zebrafish: coordination of form and function. Semin Cell Dev Biol. 13, 507-513 (2002).
- Heicklen-Klein, A., McReynolds, L. J., Evans, T. Using the zebrafish model to study GATA transcription factors. Semin Cell Dev Biol. 16, 95-106 (2005).
- Schoenebeck, J. J., Yelon, D. Illuminating cardiac development: Advances in imaging add new dimensions to the utility of zebrafish genetics. Semin Cell Dev Biol. 18, 27-35 (2007).
- Beis, D. Genetic and cellular analyses of zebrafish atrioventricular cushion and valve development. Development. 132, 4193-4204 (2005).
- Lepilina, A. A dynamic epicardial injury response supports progenitor cell activity during zebrafish heart regeneration. Cell. 127, 607-619 (2006).
- Wills, A. A., Holdway, J. E., Major, R. J., Poss, K. D. Regulated addition of new myocardial and epicardial cells fosters homeostatic cardiac growth and maintenance in adult zebrafish. Development. 135, 183-192 (2008).
- Parichy, D. M., Elizondo, M. R., Mills, M. G., Gordon, T. N., Engeszer, R. E. Normal table of postembryonic zebrafish development: staging by externally visible anatomy of the living fish. Dev Dyn. 238, 2975-3015 (2009).
- Huang, C. J., Tu, C. T., Hsiao, C. D., Hsieh, F. J., Tsai, H. J. Germ-line transmission of a myocardium-specific GFP transgene reveals critical regulatory elements in the cardiac myosin light chain 2 promoter of zebrafish. Dev Dyn. 228, 30-40 (2003).
- Westerfield, M. The Zebrafish Book, A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio). , University of Oregon Press. (1995).
