Summary
Een duidelijke, gestandaardiseerde methode voor dissectie en isolatie van de zebravis hart op meerdere ontwikkelingsstadia worden beschreven. Annotatie en kwantificatie technieken worden ook besproken.
Abstract
Zebravis zijn uitgegroeid tot een nuttig en praktisch modelorganisme voor de studie van de embryonale ontwikkeling van het hart (zie recente recensies 1-6), werken echter te onderzoeken post-embryonale via volwassenenonderwijs ontwikkeling van het hart is beperkt 7-10. Onderzoeken van de veranderende morfologie van de rijping en veroudering hart zijn beperkt door het gebrek aan technieken beschikbaar voor het organiseren en het isoleren van jeugdige en volwassen harten. Om de ontwikkeling van het hart te analyseren gedurende de levensduur van de vis, ontleden we zebravis harten op tal van podia en fotograferen ze voor verdere analyse 11. De morfologische kenmerken van het hart kan gemakkelijk worden gekwantificeerd en de individuele harten kan verder worden geanalyseerd door een groot aantal standaard methoden. Zebravis groeien variabele rente en de rijping correleert beter met grootte van de vis dan leeftijd, dus post-fixatie, we fotograferen en meten vis lengte als een graadmeter van vis rijping. Dit protocol legt uit twee verschillende, grootteafhankelijke dissectie technieken voor zebravis, variërend van larven 3.5mm standaard lengte (SL) met een hart van 100 urn ventrikel lengte (VL), voor volwassenen, met SL van 30mm en VL 1 mm of groter. Larvale en volwassen vissen hebben zeer verschillend lichaam en orgel morfologie. Larven zijn niet alleen aanzienlijk kleiner, ze hebben minder pigment en elk orgaan is visueel erg moeilijk te identificeren. Om deze reden maken we gebruik van verschillende dissectie technieken.
We gebruikten pre-dissectie fixatie, zoals wij ontdekten dat de harten direct ontleed na euthanization een meer variabele morfologie hebben, met zeer losse en ballon, zoals atria in vergelijking met hartjes verwijderd na fixatie. De vis vast voorafgaand aan de dissectie, te behouden in vivo morfologie en kamer positie (gegevens niet getoond). Bovendien, voor demonstratiedoeleinden, we profiteren van het hart (myocard) specifieke GFP transgene Tg (myl7: GFP) twu34 (12), die ons in staat stelt te visualiseren het hele hart en is met name nuttig in een vroeg stadium in de ontwikkeling als de cardiale morfologie is minder onderscheiden van omliggende weefsels. Dissectie van het hart maakt verdere analyse van de cel-en moleculaire biologie onderliggende ontwikkeling van het hart en rijping behulp van in situ hybridisatie, immunohistochemie, RNA-extractie of andere analytische methoden gemakkelijker in post-embryonale zebravis. Dit protocol zal een waardevolle techniek voor de studie van ontwikkeling van het hart rijping en veroudering.
Protocol
Zebravissen zijn gerezen met behulp van standaardprotocollen 13 in het Queens College Animal Facility bij 28 ° C. Afzonderlijke vis paren of groepen paringen moet worden voorgevormd en de ontstane embryo's gereinigd en opgeslagen in een 28 ° C incubator. Gezondheid van de vissen moet dagelijks worden onderzocht. Op 5-dagen na de bevruchting (DPF), moet vis worden gescheiden in tanks bij een 10-15 vis dichtheid en ingevoerd in de vis-faciliteit kwekerij. Voor het protocol hier gepresenteerde zebravis werden verzameld bij de larve volwassen stadia door: 15, 30, 45, 60, 90, 180 DPF.
1. Zebravis onderwerp verzamelen en fixatie
- Haal de vis uit leefgebied tank met behulp van de netto en doe dit in 0,2% tricaïne te verdoven.
- Plaats verdoofd vis in ijs water gedurende 15 minuten te euthanaseren.
- Het maken van verse 4% paraformaldehyde (PFA) in 1x fosfaat-gebufferde zoutoplossing (PBS).
- Incubeer verzameld vis in 4% PFA gedurende 1-2 uur bij RT daarna overnacht bij 4 ° C in een petrischaal verpakt in parafilm. Dit houdt de vis plat en maakt later dissectie veel gemakkelijker.
- Na fixatie, twee keer in PBS spoelen met Tween (PBT). Vissen kan houden in PBT bij 4 ° C gedurende maximaal 10 dagen.
2. Het meten van vis en dissectie
- Leg enkele vis in de petrischaal half gevuld met verse PBS en leg het op zijn rechterkant.
- Meet de lengte van de vis van snuit aan de basis van de staart (de staartwortel), exclusief staart vinnen, met een digitale schuifmaat mm (figuur 1). Dit is de standaard lengte (SL).
- Elke vis kan worden toegewezen aan een nummer / letter combinatie om een afzonderlijke vis en de daaruit voortvloeiende ontleed hart worden bijgehouden voor latere analyse mogelijk te maken. Gegevens, met inbegrip ouders voorraad aantal, leeftijd bij fixatie, SL-metingen, werden opgenomen in een spreadsheet en georganiseerd op basis van deze labels.
- Vóór versnijding, label PCR tube strips met tracking-nummer toegewezen en vullen met PBT-of andere oplossing geschikt is voor verdere analyse.
- Orient de vis ventrale zijde naar boven in petrischaal te stabiliseren van het lichaam met een tang houden het hoofd tussen de ogen en de kieuwen (figuur 2).
Kleinere vissen (kleiner dan 12mm SL):
- a) Met behulp van scherpe tang, of een micro-naald in een pin houder, verwijder dan de borstspieren en de vinnen van het lichaam naar het hart zichtbaar te maken. De constante beweging van de tang tijdens de dissectie kan stromen in de PBT dat de vis te verplaatsen. Dit is vooral problematisch voor kleinere vissen, dus een micro-naald kan worden gebruikt om de borstspieren en de vinnen te verwijderen en de lichaamsholte open.
- a) voorzichtig met de tang naar het hart schep van de holte onder het atrium. Afwisselend, in sommige vis die je in staat zijn om het hart te verwijderen door voorzichtig te trekken uit de bol en de rest van het hart zal volgen. Wees voorzichtig met de locatie van het atrium bij gebruik van deze techniek als het gemakkelijk kan worden beschadigd. Als er extra weefsel dat wordt geleverd met het hart, dat is prima en kan worden gewist na.
- a) Als de vis bevat een fluorescerende cardiale merker zoals Tg (myl7: GFP) twu34, gebruik fluorescerende ruimte voor dissectie en controleer of wegnemen van het hart door de bloei (figuur 3).
- a) Wanneer het hart is verwijderd uit de holte, gebruik de tang naar het hart en een micro-naald ingedrukt om extra niet-cardiale weefsel en de epicardiale voering te verwijderen van de buitenkant van het hart.
Grotere vissen (groter dan 12mm SL):
- b) Met het voorjaar behandeld micro-schaar, maken drie insnijdingen van minder dan 1 mm diep: 1 - dwarse snede door de kieuwen 2 - dwarse snede op voorste buik 3 - sagittale bezuinigen op ventrale zijde het aansluiten van zowel cuts (figuur 4).
- b) Het gebruik van scherpe tang te verwijderen van de borstspieren en de vinnen van het lichaam naar de lichaamsholte open en de zilveren weefsel van het hartzakje (figuur 5A) te onthullen. Verwijder deze pericardiale weefsel en het hart wordt zichtbaar (Figuur 5B).
- b) Met de micro-schaar om de slagader is aangesloten op de bolvormige arteriosus, gelegen superieur aan het hart te snijden. Zodra deze slagader is afgesneden, de tang tips onder het atrium zetten, gebruik dan de tang naar het hart scoop uit de holte. Als er extra weefsel dat wordt geleverd met het hart, dat is prima en kan later worden verwijderd.
- b) Als het hart is verwijderd uit de holte, gebruikt u de twee tang naar het hart vast te houden en te verwijderen extra weefsel, of een pincet om het hart vast te houden en een micro-naald om extra, niet-cardiale weefsel te verwijderen. De epicardiale voering, duidelijk door de zwarte pigment, kan worden verwijderd van de buitenkant van het hart indien gewenst door voorzichtig te schrapen het weefsel.
3. Fotografie van harten
- Bereid een 23g / L voedingsagar petrischaal en bedek gestolde agar met PBS.
- Met behulp van de tang, maak een kuiltje in het agar die het mogelijk maakt het hart om in de gewenste richting rest voor het fotograferen.
- Uitneeme het hart van de PCR-buis door te oordelen het topje van de bolvormige met de tang stevig. Plaats het hart in de agar schotel.
- Oriënteren het hart in de agar te fotograferen. Het monster kan worden gedraaid na elke foto om alle mogelijke oriëntaties (Figuur 6).
- Gebruik overhead licht en de korte blootstelling tijd om de harten te fotograferen. Aanpassingen voor lichte kwaliteit met behulp van de blootstelling als nodig is om de beste foto te krijgen.
4. Representatieve resultaten:
Een voorbeeld van een goed ontleed rein hart is te zien in meerdere richtingen in figuur 6. Elk hart zal hebben enkele verschillen in de algemene morfologie, maar het hart moet worden voltooid, met een intacte ventrikel, atrium en bolle arteriosus. Enkele voorbeelden van deze variatie in de totale morfologie worden weergegeven in figuur 7. De zwarte gevlekte epicardiale weefsel kan ook verwijderd uit het hart.
Figuur 1. Meet de vis van snuit tot staartwortel met behulp van een digitale schuifmaat mm.
Figuur 2. Houd de vis met een tang tussen de ogen en de kieuwen.
Figuur 3 Een cardiaal specifiek fluorescente transgene merker zoals Tg (myl7: GFP). Twu34, hier kan de steun in het visualiseren van harten ontleed van kleinere vissen.
Figuur 4 Drie incisies om de borstspieren en de huid te verwijderen: 1 - dwarse snede door de kieuwen 2 - dwarse snede op voorste buik 3 - sagittale bezuinigen op ventrale zijde aansluiten van beide snijwonden..
. Figuur 5 zwarte letters het etiket van de kamers van het hart: bolvormige arteriosus (ba), ventrikel (v), en het atrium (een).
A-De bovenste lichaamsholte is open voor het zilveren weefsel van het hartzakje te tonen.
B-Na het verwijderen van het hartzakje, het hart is zichtbaar en gemakkelijk te verwijderen.
Figuur 6. Verschillende oriëntaties van het hart worden weergegeven. Zwarte letters het etiket van de kamers van het hart: bolvormige arteriosus (ba), ventrikel (v), en het atrium (een). Grijze pijlen geven locatie en oriëntatie van het hart met betrekking tot zijn normale plaats in het lichaam: anterieure (A), posterior (P), rug (D), buik (V), links (L) en rechts (R). Schaal balk geeft 400μm.
A-ventrale uitzicht op het hart
B-dorsaal aanzicht van het hart
C-laterale uitzicht vanaf de linkerkant
D-laterale uitzicht vanaf de rechterkant
Figuur 7. Morfologie van de harten van verschillende grootte wordt getoond. Zwarte letters het etiket van de kamers van het hart: bolvormige arteriosus (ba), ventrikel (v), en het atrium (een). Schaalbalk aangegeven 400 micrometer.
AC-Hearts vorm vis met SL minder dan 12mm
DF-Hearts vorm vis met SL groter dan 12mm
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Deze methoden voor dissectie van de zebravis hart van de post-embryonale vis maakt het mogelijk om volledige verwijdering van een onbeschadigd hart. Hoewel deze techniek is eenvoudig en geeft gidsen voor externe bezuinigingen die voorkomt dat schade aan het hart, een vaste hand is essentieel voor kleinere vissen.
Een belangrijke stap tijdens de dissectie is om de zilverachtige hartzakje identificeren als het hart is direct in deze weg. Het visualiseren van de pericard vormt een belangrijke marker voor het vinden en uiteindelijk het verwijderen van het hart vormen van het lichaam holte. Verder zal het per ongeluk verwijderen van de bolvormige het snijden van de slagader superieur is aan de bolle arteriosus te voorkomen dat van de rest van het hart. In grotere vissen is het soms nodig om het onderste gedeelte van het lichaam te verwijderen aan het hoofd en bovenlichaam met het hart stabiel tijdens dissectie te houden. Dit kan gedaan worden door de voortzetting van de onderste dwarse snede door de lichaamsholte en de wervelkolom met een schaar.
Dissectie van de zebravis hart is niet alleen nuttig voor soortgelijke studies aan onze eigen rijping analyse, maar kan nuttig zijn in de studie van de ziekte staten van de zebravis, RNA isolatie in het hart, en in andere analytisch onderzoek gebruik te maken van het hart.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Geen belangenconflicten verklaard.
Acknowledgments
Met dank aan Marie Birne, Areti Tsiola, Jaymie Estevez en Arelys Uribe. Dit werk werd mede ondersteund door CUNY Research Foundation en Howard Hughes Medical Institute Grant zomerprogramma voor studenten (SPUR) en NIH RO3 41702-00-01. Onderzoek werd ook gesteund door Queens College en sommige van de experimenten werden uitgevoerd op apparatuur van de Core Facility for Imaging, Cellulaire en Moleculaire Biologie aan Queens College.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Paraformaldehyde | EMD Millipore | PX0055 | .04g/mL in PBS |
| Forceps #55 | Fine Science Tools | 11295-51 | |
| Micro-scissors | Fine Science Tools | 15005-08 | |
| Pin holder | Fine Science Tools | 26016-12 | |
| Micro-needles | Fine Science Tools | 10130-10 | |
| Nutrient Agar | BBL | 11472 | 23g/L in distilled H2O |
| Petri dishes | BD Biosciences | 351029 | |
| PCR 8-tube strips | USA Scientific, Inc. | 1402-2500 | |
| Digital Caliper | Fisher Scientific | 14-648-17 |
References
- Ahmad, N., Long, S., Rebagliati, M. A southpaw joins the roster: the role of the zebrafish nodal-related gene southpaw in cardiac LR asymmetry. Trends Cardiovasc Med. 14, 43-49 (2004).
- Armstrong, E. J., Bischoff, J. Heart valve development: endothelial cell signaling and differentiation. Circ Res. 95, 459-470 (2004).
- Bakkers, J., Verhoeven, M. C., Abdelilah-Seyfried, S. Shaping the zebrafish heart: from left-right axis specification to epithelial tissue morphogenesis. Dev Biol. 330, 213-220 (2009).
- Glickman, N. S., Yelon, D. Cardiac development in zebrafish: coordination of form and function. Semin Cell Dev Biol. 13, 507-513 (2002).
- Heicklen-Klein, A., McReynolds, L. J., Evans, T. Using the zebrafish model to study GATA transcription factors. Semin Cell Dev Biol. 16, 95-106 (2005).
- Schoenebeck, J. J., Yelon, D. Illuminating cardiac development: Advances in imaging add new dimensions to the utility of zebrafish genetics. Semin Cell Dev Biol. 18, 27-35 (2007).
- Beis, D. Genetic and cellular analyses of zebrafish atrioventricular cushion and valve development. Development. 132, 4193-4204 (2005).
- Lepilina, A. A dynamic epicardial injury response supports progenitor cell activity during zebrafish heart regeneration. Cell. 127, 607-619 (2006).
- Wills, A. A., Holdway, J. E., Major, R. J., Poss, K. D. Regulated addition of new myocardial and epicardial cells fosters homeostatic cardiac growth and maintenance in adult zebrafish. Development. 135, 183-192 (2008).
- Parichy, D. M., Elizondo, M. R., Mills, M. G., Gordon, T. N., Engeszer, R. E. Normal table of postembryonic zebrafish development: staging by externally visible anatomy of the living fish. Dev Dyn. 238, 2975-3015 (2009).
- Huang, C. J., Tu, C. T., Hsiao, C. D., Hsieh, F. J., Tsai, H. J. Germ-line transmission of a myocardium-specific GFP transgene reveals critical regulatory elements in the cardiac myosin light chain 2 promoter of zebrafish. Dev Dyn. 228, 30-40 (2003).
- Westerfield, M. The Zebrafish Book, A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio). , University of Oregon Press. (1995).
