Summary
एक स्पष्ट, विच्छेदन और कई विकासात्मक चरणों में zebrafish दिल के अलगाव के लिए मानकीकृत विधि वर्णित हैं. एनोटेशन और मात्रा का ठहराव तकनीकों पर भी विचार - विमर्श कर रहे हैं.
Protocol
Zebrafish मानक 28 में क्वींस कॉलेज पशु सुविधा में प्रोटोकॉल 13 डिग्री सेल्सियस का उपयोग उठाए गए थे व्यक्तिगत मछली जोड़े या समूह matings और preformed परिणामस्वरूप भ्रूण साफ और एक 28 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में संग्रहीत किया जाना चाहिए. मछली स्वास्थ्य दैनिक जांच की जानी चाहिए. 5 दिन के बाद निषेचन (DPF) पर एक 10-15 मछली घनत्व पर, मछली टैंक में अलग होना चाहिए और मछली सुविधा नर्सरी में प्रवेश किया. 15, 30, 45, 60, 90, 180 DPF: यहाँ प्रस्तुत प्रोटोकॉल के लिए zebrafish लार्वा में वयस्क चरणों के माध्यम से एकत्र किए गए थे.
1. Zebrafish विषय संग्रह और नियतन
- वास टैंक से मछली के 0.2% Tricaine में शुद्ध और स्थान का उपयोग करने के लिए anesthetize निकालें.
- 15 मिनट euthanize के लिए बर्फ के पानी में संवेदनाहृत मछली रखें.
- 1x में ताजा 4% paraformaldehyde (पीएफए) फास्फेट buffered खारा (पीबीएस).
- आरटी पर 1-2 घंटे के लिए 4% पीएफए में एकत्र मछली 4 तो रातोंरात सेते ° सी parafilm में लिपटे एक पेट्री डिश में. यह मछली फ्लैट रहता है और बाद विच्छेदन ज्यादा आसान बनाता है.
- निर्धारण के बाद, बीच (पीबीटी) के साथ पीबीएस में दो बार कुल्ला. मछली पीबीटी में 4 ° C पर 10 दिनों के लिए किया जा सकता है रखने.
2. मछली और विच्छेदन माप
- प्लेस पेट्री डिश छमाही में एकल मछली ताजा पीबीएस से भरा है और यह अपनी सही पक्ष पर रखना.
- थूथनी से पूंछ के आधार (लांगुलिय डंठल) के लिए मछली के उपाय लंबाई नहीं पूंछ पंख, एक डिजिटल मिमी कैलीपर (चित्र 1) का उपयोग कर सहित. यह मानक लंबाई (एसएल) है.
- प्रत्येक मछली / संख्या संयोजन पत्र के एक व्यक्ति मछली और जिसके परिणामस्वरूप दिल विच्छेदित करने के लिए बाद में विश्लेषण के लिए लगाया जा की अनुमति सौंपा जा सकता है. माता पिता के शेयर संख्या, निर्धारण, SL माप उम्र सहित डेटा, एक स्प्रेडशीट में प्रवेश कर रहे थे और इन लेबलों पर आधारित का आयोजन किया.
- इससे पहले विच्छेदन लेबल, सौंपा ट्रैकिंग नंबर के साथ पीसीआर ट्यूब स्ट्रिप्स और पीबीटी या आगे के विश्लेषण के लिए अन्य उपयुक्त समाधान के साथ भरने.
- ओरिएंट पेट्री डिश में मछली ventral पक्ष जबकि आँखें और गहरे नाले (चित्रा 2) के बीच सिर धारण संदंश के साथ शरीर को स्थिर.
छोटी मछली (12mm SL तुलना में छोटे):
- एक) एक पिन धारक में तेज संदंश, या एक सूक्ष्म सुई का प्रयोग, छाती पर का कवच की मांसपेशियों और पंख दिल प्रकट करने के लिए शरीर से हटा दें. विच्छेदन के दौरान संदंश का निरंतर गति पीबीटी में धाराओं कि मछली ले जाने के कारण कर सकते हैं. यह विशेष रूप से छोटी मछली है, इस प्रकार एक सूक्ष्म सुई के लिए छाती पर का कवच की मांसपेशियों और पंख हटाने और शरीर गुहा खोलने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है के लिए समस्याग्रस्त है.
- एक) धीरे संदंश का उपयोग करने के लिए दिल स्कूप आलिंद के नीचे से बाहर गुहा की. वैकल्पिक रूप से, कुछ मछली में आप के लिए धीरे बल्बनुमा बाहर खींच और दिल के बाकी का पालन करेगा से दिल को दूर करने में सक्षम हो सकता है. इस तकनीक का उपयोग कर के रूप में इसे आसानी से क्षतिग्रस्त किया जा सकता है अगर आलिंद के स्थान से सावधान रहें. यदि वहाँ अतिरिक्त ऊतक कि दिल, कि ठीक है और बाद में साफ किया जा सकता है के साथ आता है.
- क) यदि मछली (myl7 टीजी के रूप में एक फ्लोरोसेंट कार्डियक मार्कर शामिल हैं: GFP) twu34, विच्छेदन के लिए फ्लोरोसेंट गुंजाइश का उपयोग करें और दिल की पुष्पन (चित्रा 3) द्वारा हटाने की पुष्टि.
- दिल एक बार) गुहा से निकाल दिया जाता है, संदंश का उपयोग करने के लिए दिल और दिल के बाहर से अतिरिक्त गैर हृदय ऊतक और epicardial अस्तर निकालने के लिए एक सूक्ष्म सुई पकड़.
बड़ी मछली (12mm SL से अधिक):
- 2 गहरे नाले के माध्यम अनुप्रस्थ - कट - पूर्वकाल पेट में 3 अनुप्रस्थ कटौती - ventral पक्ष पर दोनों कटौती को जोड़ने के बाण के समान कटौती (चित्रा 4): 1 ख) वसंत का उपयोग संभाला कैंची सूक्ष्म, 1mm गहरी की तुलना में कम तीन चीरों करें.
- ख) तेज संदंश का प्रयोग शरीर से छाती पर का कवच की मांसपेशियों और पंख हटाने के लिए शरीर गुहा खुला और pericardium (चित्रा 5A) की चांदी ऊतक प्रकट. इस pericardial ऊतक निकालें और दिल दिखाई देने लगते हैं (चित्रा 5B).
- ख) सूक्ष्म कैंची का प्रयोग बल्बनुमा arteriosus स्थित है, दिल को बेहतर करने के लिए जुड़ा धमनी में कटौती. एक बार यह धमनी काट रहा है, atrium के तहत संदंश सुझावों डाल, संदंश उपयोग गुहा के दिल बाहर निकालना. यदि वहाँ अतिरिक्त ऊतक कि दिल है, कि ठीक है और बाद में हटाया जा सकता है के साथ आता है.
- ख) एक बार दिल गुहा से निकाल दिया जाता है, दो संदंश का उपयोग करने के लिए दिल पकड़ और अतिरिक्त ऊतक, या संदंश के एक जोड़ी को दूर करने के लिए दिल पकड़ और एक सूक्ष्म सुई अतिरिक्त, गैर हृदय ऊतक को हटाने के लिए. epicardial अस्तर, अपनी काली pigmentation के द्वारा स्पष्ट, दिल के बाहर से हटाया जा सकता है अगर धीरे ऊतक scraping द्वारा वांछित है.
3. दिल की फोटोग्राफी
- एक 23g / एल पोषक तत्व अगर पेट्री डिश तैयार है और अगर पीबीएस के साथ जम कवर.
- संदंश का प्रयोग, अगर है कि दिल वांछित अभिविन्यास में photographing के लिए आराम करने के लिए अनुमति देता में एक अच्छी तरह से बनाते हैं.
- Removई मजबूती संदंश के साथ बल्बनुमा की नोक पकड़ कर पीसीआर ट्यूब से दिल. अगर डिश में दिल को रखें.
- ओरिएंट अगर तस्वीर करने के लिए दिल में. नमूना घुमाया सभी संभव झुकाव (चित्रा 6) के लिए प्रत्येक चित्र के बाद किया जा सकता है.
- उपरि प्रकाश और कम जोखिम के समय का उपयोग करने के लिए दिल तस्वीर के लिए. प्रकाश गुणवत्ता के लिए समायोजन के रूप में सबसे अच्छी तस्वीर प्राप्त करने के लिए आवश्यक जोखिम का उपयोग करें.
4. प्रतिनिधि परिणाम:
चित्रा 6 में एक से अधिक झुकाव में एक अच्छी तरह से dissected साफ दिल का एक उदाहरण दिखाया गया है. प्रत्येक दिल समग्र आकारिकी में कुछ मतभेद हैं, लेकिन दिल पूरा हो, एक अक्षुण्ण वेंट्रिकल, atrium और बल्बनुमा arteriosus युक्त होना चाहिए. समग्र आकारिकी में इस बदलाव के कुछ उदाहरण 7 चित्र में दिखाए जाते हैं. काले चित्तीदार epicardial ऊतक भी दिल से हटाया जा सकता है.
चित्रा 1. थूथन से दुम का डंठल का उपयोग एक डिजिटल मिमी कैलीपर मछली उपाय.
चित्रा 2. आँखें और गहरे नाले के बीच संदंश के साथ मछली पकड़ो.
चित्रा 3 टीजी के रूप में एक हृदय विशिष्ट फ्लोरोसेंट ट्रांसजेनिक मार्कर (myl7: GFP). Twu34 यहाँ दिखाया, छोटी मछली से dissected दिल visualizing में सहायता कर सकते हैं.
चित्रा 4 तीन चीरों के लिए छाती पर का कवच की मांसपेशियों और त्वचा को हटाने के लिए: 1 - 2 गहरे नाले के माध्यम अनुप्रस्थ काट - पूर्वकाल पेट में 3 अनुप्रस्थ कट - ventral पक्ष पर दोनों कटौती को जोड़ने के बाण के समान कटौती.
बल्बनुमा (बीए) arteriosus, निलय (v), और आलिंद (एक): 5 चित्रा काले अक्षरों दिल की कोठरियों लेबल.
एक ऊपरी शरीर गुहा pericardium की चांदी ऊतक दिखाने के लिए खुला है.
बी के बाद pericardium हटाने, हृदय दिखाई और आसानी से हटाया है.
दिल की चित्रा 6 विभिन्न झुकाव दिखाए जाते हैं. दिल के काले अक्षरों कक्षों लेबल बल्बनुमा (बीए) arteriosus, निलय (v), और आलिंद (एक):. पूर्वकाल (ए), (पी) के पीछे, पृष्ठीय (डी), ventral (वी), छोड़ दिया (एल), और सही (नि.): ग्रे तीर स्थान और दिल के उन्मुखीकरण अपने शरीर में सामान्य स्थान के संदर्भ में संकेत मिलता है. स्केल बार 400μm इंगित करता है.
दिल के मद्देनजर एक - वेंट्रल
दिल के बी - पृष्ठीय दृश्य
बाईं ओर से सी - पार्श्व दृश्य
दाईं ओर से डी पार्श्व दृश्य
7 चित्रा विभिन्न आकारों के दिलों की आकृति विज्ञान दिखाया गया है. दिल के काले अक्षरों कक्षों लेबल बल्बनुमा (बीए) arteriosus, निलय (v), और आलिंद (एक):. स्केल बार 400 सुक्ष्ममापी संकेत दिया.
एसी दिल SL 12mm के साथ फार्म तुलना में कम मछली
DF-दिल SL के साथ फार्म मछली 12mm की तुलना में अधिक
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Discussion
बाद भ्रूण मछली के zebrafish दिल के विच्छेदन के लिए इन तरीकों एक undamaged दिल की पूरी तरह हटाने के लिए अनुमति देता है. हालांकि इस तकनीक सरल है और बाहरी कटौती है कि दिल हानिकारक को रोकने जाएगा के लिए मार्गदर्शन प्रदान करता है, एक स्थिर हाथ की छोटी मछली के लिए आवश्यक है.
विच्छेदन के दौरान एक महत्वपूर्ण कदम चांदी pericardium की पहचान के रूप में दिल इस थैली के भीतर सीधे है. Pericardium Visualizing खोजने और अंततः दिल के फार्म हटाने शरीर गुहा के लिए एक महत्वपूर्ण मार्कर प्रदान करता है. इसके अलावा, बल्बनुमा arteriosus बेहतर धमनी काटने दिल के बाकी हिस्सों से बल्बनुमा के अनजाने हटाने को रोकने जाएगा. बड़ी मछली में यह कभी कभी सिर और ऊपरी विच्छेदन के दौरान दिल स्थिर युक्त शरीर रखने के लिए शरीर के निचले हिस्से को हटाने के लिए आवश्यक है. यह शरीर और कैंची के साथ गुहा रीढ़ की हड्डी के माध्यम से कम अनुप्रस्थ कटौती जारी करके किया जा सकता है.
Zebrafish दिल का विच्छेदन न केवल हमारे अपने परिपक्वता विश्लेषण करने के लिए इसी तरह के अध्ययन के लिए उपयोगी है, लेकिन zebrafish, दिल में शाही सेना अलगाव, और अन्य विश्लेषणात्मक अनुसंधान में दिल के उपयोग के रोग राज्यों के अध्ययन में उपयोगी हो सकता है.
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Disclosures
ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.
Acknowledgments
मैरी Birne, Areti Tsiola, Jaymie Estevez और Arelys उरीबे के लिए धन्यवाद. इस काम के हिस्से में CUNY रिसर्च फाउंडेशन और हॉवर्ड ह्यूजेस मेडिकल संस्थान के स्नातक छात्रों के लिए अनुदान ग्रीष्मकालीन कार्यक्रम (प्रेरणा) और NIH RO3 41702-00-01 द्वारा समर्थित किया गया. शोध यह भी क्वींस कॉलेज और प्रयोगों के कुछ इमेजिंग क्वींस कॉलेज में सेलुलर और आणविक जीवविज्ञान के लिए कोर सुविधा से उपकरणों पर किया गया द्वारा समर्थित किया गया था.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Paraformaldehyde | EMD Millipore | PX0055 | .04g/mL in PBS |
| Forceps #55 | Fine Science Tools | 11295-51 | |
| Micro-scissors | Fine Science Tools | 15005-08 | |
| Pin holder | Fine Science Tools | 26016-12 | |
| Micro-needles | Fine Science Tools | 10130-10 | |
| Nutrient Agar | BBL | 11472 | 23g/L in distilled H2O |
| Petri dishes | BD Biosciences | 351029 | |
| PCR 8-tube strips | USA Scientific, Inc. | 1402-2500 | |
| Digital Caliper | Fisher Scientific | 14-648-17 |
References
- Ahmad, N., Long, S., Rebagliati, M. A southpaw joins the roster: the role of the zebrafish nodal-related gene southpaw in cardiac LR asymmetry. Trends Cardiovasc Med. 14, 43-49 (2004).
- Armstrong, E. J., Bischoff, J. Heart valve development: endothelial cell signaling and differentiation. Circ Res. 95, 459-470 (2004).
- Bakkers, J., Verhoeven, M. C., Abdelilah-Seyfried, S. Shaping the zebrafish heart: from left-right axis specification to epithelial tissue morphogenesis. Dev Biol. 330, 213-220 (2009).
- Glickman, N. S., Yelon, D. Cardiac development in zebrafish: coordination of form and function. Semin Cell Dev Biol. 13, 507-513 (2002).
- Heicklen-Klein, A., McReynolds, L. J., Evans, T. Using the zebrafish model to study GATA transcription factors. Semin Cell Dev Biol. 16, 95-106 (2005).
- Schoenebeck, J. J., Yelon, D. Illuminating cardiac development: Advances in imaging add new dimensions to the utility of zebrafish genetics. Semin Cell Dev Biol. 18, 27-35 (2007).
- Beis, D. Genetic and cellular analyses of zebrafish atrioventricular cushion and valve development. Development. 132, 4193-4204 (2005).
- Lepilina, A. A dynamic epicardial injury response supports progenitor cell activity during zebrafish heart regeneration. Cell. 127, 607-619 (2006).
- Wills, A. A., Holdway, J. E., Major, R. J., Poss, K. D. Regulated addition of new myocardial and epicardial cells fosters homeostatic cardiac growth and maintenance in adult zebrafish. Development. 135, 183-192 (2008).
- Parichy, D. M., Elizondo, M. R., Mills, M. G., Gordon, T. N., Engeszer, R. E. Normal table of postembryonic zebrafish development: staging by externally visible anatomy of the living fish. Dev Dyn. 238, 2975-3015 (2009).
- Huang, C. J., Tu, C. T., Hsiao, C. D., Hsieh, F. J., Tsai, H. J. Germ-line transmission of a myocardium-specific GFP transgene reveals critical regulatory elements in the cardiac myosin light chain 2 promoter of zebrafish. Dev Dyn. 228, 30-40 (2003).
- Westerfield, M. The Zebrafish Book, A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio). , University of Oregon Press. (1995).
