Summary
Ясно, стандартизованный метод вскрытия и изоляции данио сердце в несколько этапов развития, описаны. Аннотация и количественного методов, также обсуждаются.
Abstract
Данио рерио стали выгодными и практическую модель организма для исследования эмбрионального развития сердца (см. недавние обзоры 1-6), однако, работа изучения постэмбрионального до взрослых сердечных развитие было ограничено 7-10. Рассматривая изменения морфологии созревания и старения сердца ограничены из-за отсутствия методик для постановки и изоляции несовершеннолетних и взрослых сердец. Для анализа развития сердца в течение жизни рыбы, мы проанализируем данио сердца на многочисленных этапах и сфотографировать их для дальнейшего анализа 11. Морфологические особенности сердца может быть легко количественно и индивидуальных сердца может быть дополнительно проанализирован целый ряд стандартных методов. Данио рерио растут при переменной ставки и созревания лучше коррелирует с рыбой размера, чем возраст, таким образом, после фиксации мы фотографией и измерить длину рыбы в качестве датчика рыбы созревания. Этот протокол объясняет две различные, зависит от размера методы вскрытия для рыбок данио, начиная от личинок 3,5 мм длина стандартного (SL), с сердцами 100 мкм длиной желудочка (ВЛ), для взрослых, с SL 30 мм и В. Л. 1мм и более. Личинки и взрослые рыбы имеют совершенно различные тела и органов морфологии. Личинки не только значительно меньше, у них меньше пигмента и каждый орган визуально очень трудно идентифицировать. По этой причине, мы используем различные методы вскрытия.
Мы использовали предварительно рассечение процедуры фиксации, как мы выяснили, что сердца расчлененный непосредственно после euthanization имеют более изменчивой морфологией, с очень рыхлой и воздушный шар, как предсердий по сравнению с сердечками удалены после записи. Рыба фиксированной до вскрытия, сохраняют в морфологии естественных и камерной позиции (данные не приведены). Кроме того, в демонстрационных целях, мы воспользуемся сердца (инфаркт) конкретных GFP трансгенные Tg (myl7: GFP) twu34 (12), что позволяет визуализировать весь сердца и особенно полезно на ранних стадиях развития, когда сердечная морфологией менее отлична от окружающих тканей. Препарирование сердце делает дальнейший анализ клеточной и молекулярной биологии основного развития сердца и созревания использования в гибридизация, иммуногистохимии, выделения РНК или других аналитических методов легче в постэмбрионального рыбок данио. Этот протокол будет предоставлять ценную технику для изучения сердечных созревания развития и старения.
Protocol
Данио рерио были подняты с помощью стандартных протоколов 13 в животных фонда Квинс Колледж при 28 ° C. Индивидуальные пары рыб или группы вязки должны быть предварительно и в результате эмбрионы очищается и хранится в 28 ° C инкубатора. Рыба здравоохранения должны быть рассмотрены в день. В 5-дневный пост оплодотворения (DPF), рыба должны быть разделены на танков на 10-15 плотность рыбы и поступил в детскую объекта рыбы. Для протокола, представленные здесь данио были собраны на личинки до взрослых этапа: 15, 30, 45, 60, 90, 180 DPF.
1. Данио рерио коллекции субъекта и фиксация
- Удалить рыбы из среды обитания бак с использованием чистого и место в 0,2% Tricaine на анестезию.
- Место под наркозом рыбу в ледяной воде в течение 15 минут, чтобы усыпить.
- Сделать свежее 4% параформальдегида (PFA) в 1x фосфат-солевом буфере (PBS).
- Инкубируйте собраны рыбы в 4% PFA в течение 1-2 часов при комнатной температуре затем в течение ночи при температуре 4 ° С в чашке Петри, завернутые в парафильмом. Это позволяет рыбе плоские и делает позднее вскрытие гораздо проще.
- После фиксации, промыть дважды в PBS с Tween (РВТ). Рыбу можно держать в PBT при 4 ° С в течение 10 дней.
2. Измерение рыбы и рассечение
- Место одной рыбы в половину чашки Петри заполнены свежими PBS и положите ее на правый бок.
- Измерение длины рыбы от морды до основания хвоста (хвостового стебля), не включая хвостовой плавники, используя цифровые мм суппорта (рис. 1). Это стандартная длина (SL).
- Каждая рыба может быть присвоен номер / сочетание букв, чтобы отдельные рыбы и в результате расчлененный сердца, которые необходимо отслеживать для последующего анализа. Данные, в том числе родительских количество акций, возраст фиксации, SL измерений, были введены в электронную таблицу и организованы на основе этих ярлыков.
- До вскрытия, этикетка ПЦР трубки полосы с возложенными на номер для отслеживания и залейте PBT или другие соответствующие решения для дальнейшего анализа.
- Восток рыбы брюшной стороне в чашке Петри при стабилизации тела щипцами проведения головы между глазами и жабры (рис. 2).
Меньшие рыбы (меньше 12 мм SL):
- а) Использование резкого щипцов, или микро-иглы в контактный держатель, удалить грудные мышцы и плавники от тела, чтобы раскрыть сердце. Постоянное движение щипцов во время вскрытия может вызвать токи в PBT, которые движутся рыбы. Это особенно проблематично для мелких рыб, таким образом, микро-игла может быть использована для удаления грудных мышц и плавники и открытые полости тела.
- ) Аккуратно использовать щипцы, чтобы выкопать сердце из полости из-под атриумом. С другой стороны, в некоторых рыбы, которую вы можете удалить сердце, осторожно потянув луковичных, и остальные сердце будет следовать. Будьте осторожны в расположение атриума, если с помощью этой техники, как это может быть легко повреждены. Если есть дополнительная ткань, которая поставляется с сердцем, что это хорошо и может быть снят после.
- а) Если рыба содержит флуоресцентных маркеров сердечного таких как Tg (myl7: GFP) twu34, использовать люминесцентные возможности для вскрытия и проверки устранения сердце цветения (рис. 3).
- а) Как только сердце удаляется из полости, использование щипцов, чтобы держать сердце и микро-иглы для удаления лишних без сердечной ткани и эпикарда подкладкой со стороны сердца.
Большие рыбы (более 12 мм SL):
- б) Используя весной обрабатываются микро-ножницы, сделайте три разреза составляет менее 1 мм глубокая: 1 - поперечный разрез через жабры 2 - поперечный разрез на передней живота 3 - сагиттального разреза на брюшной стороне подключении обоих разрезов (рис. 4).
- б) С помощью пинцета удалите резкие грудные мышцы и плавники от тела, чтобы открыть полости тела и выявить серебристой ткани перикарда (рис. 5А). Удалить эту перикардиальной ткани и сердца станет видимым (рис. 5B).
- б) использовать микро-ножницы, чтобы вырезать артерии связан с луковичными артериальный, расположенных выше сердца. Как только эта артерия режется, положите щипцы советы под атриум, использование щипцов, чтобы выкопать сердце из полости. Если есть дополнительная ткань, которая поставляется с сердцем, что это хорошо и может быть удален позже.
- б) Как только сердце удаляется из полости, использовать два пинцета держать сердце и удалить лишние ткани, или одна пара щипцов держать сердце и микро-иглы для удаления лишних, не-сердечной ткани. Эпикардиальных подкладка, очевидно по его черной пигментацией, может быть удалена с внешней стороны сердца при желании, аккуратно очищая ткани.
3. Фотография сердец
- Подготовка 23г / л питательного агара чашки Петри и покрывают затвердевших агар с PBS.
- Использование щипцов, чтобы хорошо в агар, который позволяет сердцу отдохнуть в желаемой ориентации для фотографирования.
- Removэлектронной сердце от ПЦР-пробирку, держа кончик луковичных с пинцетом твердо. Место в сердце агар блюдо.
- Восток сердце в агар сфотографировать. Образец может быть повернут после каждой фотографии для всех возможных ориентаций (рис. 6).
- Используйте верхний свет и короткие выдержки, чтобы сфотографировать сердцах. Внесите изменения для легких качества с использованием воздействия, сколько необходимо для получения лучших фотографий.
4. Представитель Результаты:
Примером хорошо расчлененные чистым сердцем показан в нескольких направлениях на рисунке 6. Каждое сердце будет иметь некоторые различия в общей морфологии, но сердце должно быть полным, содержащие нетронутыми желудочка, атриум и луковичных артериальный. Некоторые примеры этих изменений в общей морфологии показано на рисунке 7. Черный пятнистый эпикардиальных тканей можно также удалить из сердца.
Рисунок 1. Измерьте рыбу от морды до хвостового стебля с помощью цифрового мм суппорта.
Рисунок 2. Держите рыбу щипцами между глаз и жабр.
Рисунок 3 сердечной конкретных флуоресцентного маркера трансгенных таких как Tg (myl7: GFP). Twu34, показанный здесь, может помочь в визуализации сердца расчлененное из более мелких рыб.
Рисунок 4 Три разрезов для удаления грудных мышц и кожи: 1 - поперечный разрез через жабры 2 - поперечный разрез на передней живота 3 - сагиттального разреза на брюшной стороне подключении обоих сокращений..
. Рисунок 5 черными буквами этикетке камеры сердца: луковичные артериальный (BA), желудочек (у), а также атриум (а).
-Верхняя полость органа открытого показать серебристой ткани перикарда.
В-После удаления перикарда, сердца видна и легко удаляется.
Рисунок 6. Различные ориентации сердца показано на рисунке. Черные буквы этикетка камеры сердца: луковичные артериальный (BA), желудочек (у), а также атриум (а). Серые стрелки указывают местоположение и ориентацию сердце по отношению к своему нормальному расположению в теле: передние (А), задний (P), спинной (D), вентральный (V), левый (L) и правый (R). Шкала полоса указывает 400μm.
-Вид снизу сердца
В-спинной стороны сердца
С-вид сбоку с левой стороны
D-вид сбоку с правой стороны
Рисунок 7. Морфология сердца различных размеров показано. Черные буквы этикетка камеры сердца: луковичные артериальный (BA), желудочек (у), а также атриум (а). Шкала бар указано 400 мкм.
AC-Hearts форме рыбы с SL менее 12 мм
DF-Hearts форме рыбы с SL больше 12 мм
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Эти методы вскрытия данио сердце постэмбрионального рыбы позволяет полное удаление неповрежденной сердце. Хотя этот метод прост и дает направляющие для внешних разрезов, что позволит предотвратить повреждение сердца, твердая рука, имеет важное значение для более мелких рыб.
Ключевым шагом в процессе вскрытия является выявление серебристо перикарда, как сердце прямо в этом мешке. Визуализация перикарда является важным маркером для поиска и удаления в конце концов сердце форму полости тела. Далее, режущих артерии превосходят луковичных артериального предотвратит случайное удаление луковичных от остальной части сердца. В крупную рыбу иногда бывает необходимо удалить нижнюю часть тела, чтобы держать головы и верхней части тела, содержащего сердце стабильным в течение рассечение. Это может быть сделано путем продолжения ниже поперечный разрез через полость тела и позвоночника с помощью ножниц.
Препарирование данио сердце не только полезно для подобных исследований для нашего собственного анализа созревания, но может быть полезна при изучении болезни состояния рыбок данио, РНК изоляции в сердце, и в других аналитических исследований использования сердце.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Нет конфликта интересов объявлены.
Acknowledgments
Благодаря Марии Birne, Areti Tsiola, Джейми Эстевез и Arelys Урибе. Эта работа была частично поддержана CUNY Фонд исследований и Медицинского института Говарда Хьюза Грант летняя программа для студентов (шпора) и NIH RO3 41702-00-01. Исследование было поддержано Queens College и некоторые эксперименты были выполнены на оборудовании от основной фонд для работы с изображениями, клеточной и молекулярной биологии в Квинс Колледж.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Paraformaldehyde | EMD Millipore | PX0055 | .04g/mL in PBS |
| Forceps #55 | Fine Science Tools | 11295-51 | |
| Micro-scissors | Fine Science Tools | 15005-08 | |
| Pin holder | Fine Science Tools | 26016-12 | |
| Micro-needles | Fine Science Tools | 10130-10 | |
| Nutrient Agar | BBL | 11472 | 23g/L in distilled H2O |
| Petri dishes | BD Biosciences | 351029 | |
| PCR 8-tube strips | USA Scientific, Inc. | 1402-2500 | |
| Digital Caliper | Fisher Scientific | 14-648-17 |
References
- Ahmad, N., Long, S., Rebagliati, M. A southpaw joins the roster: the role of the zebrafish nodal-related gene southpaw in cardiac LR asymmetry. Trends Cardiovasc Med. 14, 43-49 (2004).
- Armstrong, E. J., Bischoff, J. Heart valve development: endothelial cell signaling and differentiation. Circ Res. 95, 459-470 (2004).
- Bakkers, J., Verhoeven, M. C., Abdelilah-Seyfried, S. Shaping the zebrafish heart: from left-right axis specification to epithelial tissue morphogenesis. Dev Biol. 330, 213-220 (2009).
- Glickman, N. S., Yelon, D. Cardiac development in zebrafish: coordination of form and function. Semin Cell Dev Biol. 13, 507-513 (2002).
- Heicklen-Klein, A., McReynolds, L. J., Evans, T. Using the zebrafish model to study GATA transcription factors. Semin Cell Dev Biol. 16, 95-106 (2005).
- Schoenebeck, J. J., Yelon, D. Illuminating cardiac development: Advances in imaging add new dimensions to the utility of zebrafish genetics. Semin Cell Dev Biol. 18, 27-35 (2007).
- Beis, D. Genetic and cellular analyses of zebrafish atrioventricular cushion and valve development. Development. 132, 4193-4204 (2005).
- Lepilina, A. A dynamic epicardial injury response supports progenitor cell activity during zebrafish heart regeneration. Cell. 127, 607-619 (2006).
- Wills, A. A., Holdway, J. E., Major, R. J., Poss, K. D. Regulated addition of new myocardial and epicardial cells fosters homeostatic cardiac growth and maintenance in adult zebrafish. Development. 135, 183-192 (2008).
- Parichy, D. M., Elizondo, M. R., Mills, M. G., Gordon, T. N., Engeszer, R. E. Normal table of postembryonic zebrafish development: staging by externally visible anatomy of the living fish. Dev Dyn. 238, 2975-3015 (2009).
- Huang, C. J., Tu, C. T., Hsiao, C. D., Hsieh, F. J., Tsai, H. J. Germ-line transmission of a myocardium-specific GFP transgene reveals critical regulatory elements in the cardiac myosin light chain 2 promoter of zebrafish. Dev Dyn. 228, 30-40 (2003).
- Westerfield, M. The Zebrafish Book, A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio). , University of Oregon Press. (1995).
