Summary
Eine klare, standardisierte Methode zur Präparation und Isolierung des Zebrafisch-Herzen an mehreren Entwicklungsstufen beschrieben sind. Annotation und Quantifizierung Techniken werden ebenfalls diskutiert.
Abstract
Zebrafische haben sich zu einem nützlichen und praktischen Modell-Organismus für die Untersuchung der embryonalen Entwicklung des Herzens (siehe letzter Zeit 1-6), jedoch arbeiten die Prüfung post-embryonale durch erwachsene Herzentwicklung wurde 7-10 beschränkt. Die Untersuchung der Veränderung der Morphologie der Reifung und Alterung Herzen sind durch den Mangel an verfügbaren Techniken für die Inszenierung und das Isolieren jugendlichen und erwachsenen Herzen eingeschränkt. Um die Entwicklung des Herzens über die Fische die Lebensdauer zu analysieren, sezieren wir Zebrafisch Herzen auf zahlreichen Bühnen und fotografieren sie für die weitere Analyse 11. Die morphologischen Eigenschaften des Herzens lassen sich leicht quantifizieren und einzelnen Herzen kann durch eine Vielzahl von Standard-Methoden analysiert werden. Zebrafische zu variablen Zinssätzen wachsen und Reifung korreliert besser mit der Größe der Fische als das Alter, also nach der Fixierung, wir fotografieren und messen Fisch Länge als ein Maß für Fisch Reifung. Dieses Protokoll erklärt zwei unterschiedliche, Größe abhängig Dissektion Techniken für die Zebrafisch, von Larven 3,5 mm Standard-Länge (SL) mit einem Herzen aus 100 um Ventrikels (VL), für Erwachsene, mit SL von 30mm und VL 1 mm oder größer. Larven und ausgewachsene Fische haben ganz unterschiedliche Körper-und Organ-Morphologie. Die Larven sind nicht nur deutlich kleiner, sie haben weniger Pigment und jedes Organ ist optisch sehr schwer zu identifizieren. Aus diesem Grund verwenden wir verschiedene Techniken Dissektion.
Wir verwendeten Pre-Dissektion der Fixierung, als wir entdeckten, dass Herz direkt nach euthanization seziert eine variable Morphologie haben, mit sehr locker und Ballon wie Atrien im Vergleich mit Herzen entfernt folgende Fixierung. Der Fisch vor dem Tag Dissektion, behalten in vivo Morphologie und Kammer-Position (Daten nicht gezeigt). Darüber hinaus ist für Demonstrationszwecke, nutzen wir das Herz (Herzinfarkt) spezifische GFP transgenen Tg (myl7: GFP) twu34 (12), die uns das gesamte Herz visualisieren können und ist besonders nützlich in einem frühen Stadium in der Entwicklung, wenn das Herz Morphologie ist weniger deutlich vom umgebenden Gewebe. Präparation des Herzens macht eine weitere Analyse der Zell-und Molekularbiologie zugrunde liegenden Herz Entwicklung und Reifung mit in-situ-Hybridisierung, Immunhistochemie, RNA-Extraktion oder andere analytische Methoden leichter in post-embryonale Zebrafisch. Dieses Protokoll wird eine wertvolle Technik für die Untersuchung der kardialen Entwicklung Reifung und Alterung.
Protocol
Zebrafisch erhoben wurden mit Standardprotokollen 13 in der Queens College Tierhaltung bei 28 ° C. Individuelle Fische paarweise oder in Gruppen Paarungen sollten vorgeformt und die daraus resultierenden Embryonen gereinigt und in einem 28 ° C Inkubator. Die Gesundheit der Fische sollten täglich überprüft werden. Bei 5-Tage nach der Befruchtung (DPF), sollten die Fische in Tanks bei einer 10-15 Fischdichte getrennt werden und in die Fisch-Anlage Kinderzimmer. 15, 30, 45, 60, 90, 180 dpf: Für das Protokoll hier vorgestellten Zebrafisch wurden Larve durch adulte Stadien gesammelt.
1. Zebrafisch Thema Sammlung und Fixierung
- Entfernen Sie Fisch aus Lebensraum Tank mit Netz und in 0,2% Tricaine zu betäuben.
- Legen Sie narkotisierten Fisch in Eiswasser für 15 Minuten bis einschläfern.
- Machen Sie frischen 4% Paraformaldehyd (PFA) in 1x Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung (PBS).
- Inkubieren gesammelt Fisch in 4% PFA für 1-2 Stunden bei RT über Nacht bei 4 ° C in einer Petrischale in Parafilm umwickelt. Das hält die Fische flach und macht später Dissektion viel einfacher.
- Nach der Fixierung zweimal in PBS gründlich mit Tween (PBT). Fische können in PBT werden halten bei 4 ° C für bis zu 10 Tage.
2. Mess-Fisch und Dissektion
- Legen Sie einzelne Fische in Petrischale zur Hälfte mit frischem PBS gefüllt und legen Sie es auf der rechten Seite.
- Messen Sie die Länge der Fische von der Schnauze bis Rutenansatz (die Schwanzflosse), ohne Heckflossen, mit einem digitalen Messschieber mm (Abbildung 1). Dies ist die Standard-Länge (SL).
- Jeder Fisch kann eine Zahl / Buchstaben-Kombination zu einem einzelnen Fisch und die daraus resultierenden seziert Herz für die spätere Analyse verfolgt werden können zugeordnet werden. Daten, einschließlich der elterlichen Lager Anzahl, Alter bei Fixierung, SL-Messungen wurden in ein Tabellenkalkulationsprogramm eingegeben und organisiert auf diesen Etiketten basiert.
- Vor Dissektion Label PCR-Röhrchen-Streifen mit Tracking-Nummer zugeordnet und mit PBT-oder andere angemessene Lösung für die weitere Analyse zu füllen.
- Richten Sie den Fisch Bauchseite bis in Petrischale, während die Stabilisierung des Körpers mit einer Pinzette hält den Kopf zwischen den Augen und Kiemen (Abbildung 2).
Kleinere Fische (kleiner als 12mm SL):
- a) Mit scharfen Pinzette oder einer Mikro-Nadel in einem Stifthalter, entfernen Sie die Brustmuskeln und Flossen aus dem Körper zum Herzen zu offenbaren. Die konstante Bewegung der Zange beim Präparieren kann Ströme im PBT, dass die Fische zu bewegen. Dies ist besonders problematisch für kleinere Fische, also ein Mikro-Nadel kann verwendet werden, um Brustmuskeln und Flossen entfernen und öffnen Sie die Körperhöhle werden.
- a) Sie vorsichtig mit der Pinzette in das Herz Schaufel aus dem Hohlraum unter dem Atrium. Alternativ in ein paar Fische können Sie möglicherweise das Herz, indem Sie vorsichtig die bauchige aus und der Rest des Herzens folgen zu entfernen. Achten Sie auf die Lage des Atriums, wenn mit dieser Technik, da es leicht beschädigt werden können. Wenn es sich um zusätzliche Gewebe, das mit dem Herzen, das ist in Ordnung und kann nach geräumt werden wird.
- a) Wenn der Fisch enthält einen fluoreszierenden kardiale Marker wie Tg (myl7: GFP) twu34, verwenden fluoreszierende Spielraum für Zerlegung und überprüfen Entfernen des Herzens durch Fluoreszenz (Abbildung 3).
- a) Wenn das Herz aus dem Hohlraum entfernt ist, verwenden Sie die Zange, um das Herz und ein Mikro-Nadel halten, um zusätzliche nicht-kardialen Gewebe und der epikardialen Futter aus dem außerhalb des Herzens zu entfernen.
Größere Fische (größer als 12 mm SL):
- b) Mit Feder behandelt Mikro-Schere, machen drei Schnitte von weniger als 1mm tief: 1 - Schnitt quer durch die Kiemen 2 - Schnitt quer am vorderen Bauch 3 - sagittal geschnitten auf Bauchseite verbindet die beiden Schnitte (Abbildung 4).
- b) Mit scharfen Pinzette entfernen Sie die Brustmuskeln und Flossen aus dem Körper in die Leibeshöhle öffnen und zeigen die silbrigen Gewebe des Perikards (Abbildung 5A). Entfernen Sie diese Perikardgewebe und das Herz wird sichtbar (Abbildung 5B).
- b) Mit der Mikro-Schere, um die Arterie mit dem bauchigen arteriosus, befindet sich über dem Herzen schneiden. Sobald diese Arterie zu senken, das Pinzette Tipps unter dem Atrium, verwenden Sie die Zange, um das Herz Schaufel aus dem Hohlraum. Wenn es sich um zusätzliche Gewebe, das mit dem Herzen, das ist in Ordnung und kann später entfernt werden wird.
- b) Wenn das Herz aus dem Hohlraum entfernt ist, werden die zwei Zangen an das Herz zu halten und zu entfernen Extra-Gewebe oder eine Pinzette, um das Herz zu halten und ein Mikro-Nadel, um zusätzliche, nicht-kardialen Gewebe zu entfernen. Die epikardialen Futter, offensichtlich durch seine schwarze Pigmentierung, kann von der Außenseite des Herzens entfernt werden, wenn durch vorsichtiges Schaben das Gewebe gewünscht.
3. Fotografie der Herzen
- Bereiten Sie eine 23g / L Nähragar Petrischale und decken erstarrten Agar mit PBS.
- Mit der Zange, eine Vertiefung in den Agar, dass das Herz in die gewünschte Ausrichtung für Aufnahmen Rest ermöglicht.
- Remove des Herzens aus dem PCR-Röhrchen, indem die Spitze des bauchigen mit der Zange fest. Legen Sie das Herz in die Agar-Schale.
- Orient im Herzen in Agar zu fotografieren. Die Probe kann gedreht werden, nach jedem Bild, um alle möglichen Orientierungen (Abbildung 6).
- Verwenden Sie Oberlicht und kurze Belichtungszeit, um die Herzen zu fotografieren. Nehmen Sie die Einstellung für die Lichtqualität mit der Exposition als notwendig, um die beste Aufnahme zu erhalten.
4. Repräsentative Ergebnisse:
Ein Beispiel für einen gut präparierten reines Herz ist in mehreren Ausrichtungen in Abbildung 6 dargestellt. Jedes Herz wird einige Unterschiede in der Morphologie insgesamt, aber das Herz sollte vollständig sein, mit einer intakten Ventrikel, Atrium und bauchige arteriosus. Einige Beispiele für diese Variante in insgesamt Morphologie sind in Abbildung 7 gezeigt. Die schwarz getupften epikardialen Gewebe kann auch aus dem Herzen entfernt.
Abbildung 1. Messen Sie den Fisch aus der Schnauze bis zum Schwanzstiel mit einem digitalen mm Dicke.
Abbildung 2. Halten Sie den Fisch mit einer Zange zwischen den Augen und Kiemen.
Abbildung 3 A kardiale spezifische fluoreszierende Marker, wie transgenen Tg (myl7: GFP). Twu34, hier gezeigt, kann bei der Visualisierung Herzen von kleineren Fischen seziert Hilfe.
Abbildung 4 Drei Einschnitte, die Brustmuskeln und die Haut entfernen: 1 - Schnitt quer durch die Kiemen 2 - Schnitt quer am vorderen Bauch 3 - sagittal geschnitten auf Bauchseite verbindet die beiden Schnitte..
. Abbildung 5 Black Briefe beschriften Sie die Kammern des Herzens: bauchige arteriosus (ba), Ventrikel (v), und Atrium (a).
A-Das obere Leibeshöhle ist offen für den silbrigen Gewebe des Herzbeutels zeigen.
B-Nach dem Entfernen der Herzbeutel, das Herz ist sichtbar und leicht zu entfernen.
Abbildung 6. Unterschiedliche Orientierungen des Herzens gezeigt. Schwarze Buchstaben beschriften Sie die Kammern des Herzens: bauchige arteriosus (ba), Ventrikel (v), und Atrium (a). Graue Pfeile zeigen Lage und Orientierung des Herzens in Bezug auf seine normale Lage im Körper: anterior (A), posterior (P), dorsal (D), ventral (V), links (L) und rechte (R). Maßstabsbalken zeigt 400μm.
A-ventral des Herzens
B-Dorsalansicht des Herzens
C-Seitenansicht von der linken Seite
D-Seitenansicht von der rechten Seite
Abbildung 7. Morphologie der Herzen in verschiedenen Größen dargestellt. Schwarze Buchstaben beschriften Sie die Kammern des Herzens: bauchige arteriosus (ba), Ventrikel (v), und Atrium (a). Skala bar angegeben 400 um.
AC-Hearts Form Fisch mit SL weniger als 12mm
DF-Hearts Form Fisch mit SL größer als 12mm
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Discussion
Diese Methoden zur Präparation des Zebrafisch-Herzen post-embryonale Fisch ermöglicht die vollständige Entfernung von einem unbeschädigten Herzen. Während diese Technik ist unkompliziert und bietet Führungen für externe Schnitte, die eine Beschädigung des Herzens wird, ist eine ruhige Hand unerlässlich für kleinere Fische.
Ein wichtiger Schritt bei der Präparation ist es, die silbrig Herzbeutel zu identifizieren, wie das Herz befindet sich direkt in diesem Sack. Visualisierung der Herzbeutel ist ein wichtiger Marker für das Auffinden und letztlich Beseitigung des Herzens bilden die Körperhöhle. Darüber hinaus wird Schneiden der Arterie über dem bauchigen arteriosus die versehentliche Entfernung der bauchigen vom Rest des Herzens zu verhindern. In größeren Fischen ist es manchmal notwendig, um den unteren Teil des Körpers zu entfernen, um den Kopf und Oberkörper mit dem Herzen stabil während der Präparation zu halten. Dies kann durch die Fortsetzung des unteren Schnitt quer durch die Leibeshöhle und der Wirbelsäule mit einer Schere erfolgen.
Präparation des Zebrafisch-Herz ist nicht nur für ähnliche Studien zu unserem eigenen Reifung Analyse nützlich, kann aber in der Studie von Krankheitszuständen der Zebrafisch, RNA-Isolierung in den Herzen und in anderen analytischen Forschung und nutzt das Herz nützlich.
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Disclosures
Keine Interessenskonflikte erklärt.
Acknowledgments
Dank Marie Birne, Areti Tsiola, Jaymie Estevez und Arelys Uribe. Diese Arbeit wurde teilweise durch CUNY Research Foundation und Howard Hughes Medical Institute Stipendium Summer Program für Undergraduate Students (SPUR) und NIH RO3 41702-00-01 unterstützt. Forschung wurde auch von Queens College und einige der Experimente wurden an Geräten aus der Core Facility for Imaging, Cellular and Molecular Biology am Queens College getan unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Paraformaldehyde | EMD Millipore | PX0055 | .04g/mL in PBS |
| Forceps #55 | Fine Science Tools | 11295-51 | |
| Micro-scissors | Fine Science Tools | 15005-08 | |
| Pin holder | Fine Science Tools | 26016-12 | |
| Micro-needles | Fine Science Tools | 10130-10 | |
| Nutrient Agar | BBL | 11472 | 23g/L in distilled H2O |
| Petri dishes | BD Biosciences | 351029 | |
| PCR 8-tube strips | USA Scientific, Inc. | 1402-2500 | |
| Digital Caliper | Fisher Scientific | 14-648-17 |
References
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