Summary
Un chiaro, metodo standardizzato per la dissezione e l'isolamento del cuore zebrafish a più stadi di sviluppo sono descritti. Tecniche di annotazione e la quantificazione vengono anche discussi.
Abstract
Zebrafish sono diventati un organismo modello utile e pratico per lo studio dello sviluppo embrionale cuore (vedi recensioni più recenti 1-6), tuttavia, il lavoro esaminando post-embrionale attraverso lo sviluppo cardiaco adulto è stato limitato 7-10. Esaminando la morfologia cambia del cuore maturazione e l'invecchiamento sono limitate dalla mancanza di tecniche disponibili per la stadiazione e isolare i cuori giovani che adulti. Al fine di analizzare lo sviluppo cuore oltre la durata della vita del pesce, si sezionano i cuori pesce zebra in numerose fasi e fotografarli per ulteriori analisi 11. Le caratteristiche morfologiche del cuore può essere facilmente quantificata e cuori individuali possono essere ulteriormente analizzati da una serie di metodi standard. Zebrafish crescere a tassi variabili e la maturazione si correla meglio con dimensione dei pesci di età, quindi, post-fissazione, abbiamo lunghezza pesce fotografare e misurare come un indicatore di maturazione di pesce. Questo protocollo spiega due distinte tecniche di dissezione dimensioni dipendenti per zebrafish, che vanno dalla lunghezza standard di larve da 3,5 mm (SL) con i cuori di lunghezza ventricolo 100μm (VL), agli adulti, con SL di 30mm e VL 1mm o più grandi. Larve e adulti hanno il corpo ben distinte e la morfologia degli organi. Le larve non sono solo molto più piccoli, hanno meno pigmento e ogni organo è visivamente molto difficile da identificare. Per questa ragione, usiamo tecniche di dissezione distinte.
Abbiamo usato pre-dissezione procedure di fissaggio, come abbiamo scoperto che il cuore sezionato direttamente dopo euthanization hanno una morfologia più variabile, con palloncino molto sciolto e, come atri rispetto al cuore rimosso fissazione seguente. Il pesce fisso prima di dissezione, trattenere in vivo la morfologia e la posizione della camera (dati non riportati). In aggiunta, a scopo dimostrativo, approfittiamo del cuore (infarto) specifiche GFP transgenici Tg (myl7: GFP) twu34 (12), che ci permette di visualizzare il cuore e il servizio è particolarmente utile nelle fasi iniziali di sviluppo quando la cardiaco morfologia è meno distinto dai tessuti circostanti. Dissezione del cuore fa un'ulteriore analisi della biologia cellulare e molecolare alla base dello sviluppo del cuore e con la maturazione di ibridazione in situ, immunoistochimica, estrazione di RNA o altri metodi analitici più facile in post-embrionale di zebrafish. Questo protocollo fornisce una valida tecnica per lo studio della maturazione dello sviluppo cardiaco e l'invecchiamento.
Protocol
Zebrafish sono state sollevate utilizzando protocolli standard 13 nel Fondo Queens College di animali a 28 ° C. Coppie o singoli pesci accoppiamenti gruppo dovrebbe essere preformato e gli embrioni risultanti puliti e conservati in un incubatore 28 ° C. Salute dei pesci dovrebbero essere esaminati ogni giorno. A 5 giorni di fecondazione post (DPF), il pesce deve essere separata in vasche ad una densità 10-15 pesce ed è entrato in funzione il vivaio di pesci. Per il protocollo presentato qui zebrafish sono stati raccolti attraverso le fasi di larva adulto: 15, 30, 45, 60, 90, 180 dpf.
1. Zebrafish raccolta soggetto e la fissazione
- Rimuovere il pesce dal serbatoio habitat tramite rete e mettere in Tricaine 0,2% per anestetizzare.
- Mettere i pesci anestetizzati in acqua ghiacciata per 15 minuti per eutanasia.
- Fai fresca paraformaldeide 4% (PFA) in 1x PBS (PBS).
- Incubare i pesci raccolti in PFA 4% per 1-2 ore a temperatura ambiente poi la notte a 4 ° C in una capsula di Petri avvolto in parafilm. Ciò mantiene il piatto di pesce e rende molto più facile dopo la dissezione.
- Dopo la fissazione, lavare due volte in PBS con Tween (PBT). Pesce può essere mantenuto in PBT a 4 ° C per un massimo di 10 giorni.
2. Misura di pesce e la dissezione
- Pesce singolo posto in mezzo piastra di Petri riempita con PBS fresco e appoggiarla sul lato destro.
- Misurare la lunghezza del pesce dal muso alla base della coda (peduncolo caudale), non comprese le pinne di coda, con una pinza digitale millimetri (figura 1). Questa è la lunghezza standard (SL).
- Ogni pesce può essere assegnato un numero / combinazione di lettere per consentire un singolo pesce e il cuore risulta sezionato per essere monitorati per una successiva analisi. Dati, tra cui il numero dei genitori magazzino, età alla fissazione, misure SL, sono stati inseriti in un foglio elettronico e organizzato sulla base di queste etichette.
- Prima della dissezione, etichetta strisce tubo PCR con numero di tracking assegnato e riempire con PBT o altre soluzioni appropriate per ulteriori analisi.
- Orientare il lato ventrale pesce in piastra di Petri, mentre la stabilizzazione del corpo con una pinza tenendo la testa tra gli occhi e le branchie (Figura 2).
Pesci più piccoli (inferiori a 12 millimetri SL):
- a) Con pinze taglienti, o un micro-ago in un supporto perno, rimuovere i muscoli pettorali e le pinne dal corpo per rivelare il cuore. Il movimento costante del forcipe durante la dissezione può causare correnti nel PBT che si muovono i pesci. Ciò è particolarmente problematico per i pesci più piccoli, quindi un micro-ago può essere usato per rimuovere i muscoli pettorali e le pinne e aprire la cavità del corpo.
- a) delicatamente usare il forcipe per raccogliere il cuore fuori della cavità da sotto l'atrio. In alternativa, in alcuni pesci si può essere in grado di rimuovere il cuore con delicatezza tirando fuori il bulbo e il resto del cuore seguirà. Fare attenzione della posizione dell'atrio se si usa questa tecnica come si può facilmente danneggiarsi. Se vi è il tessuto in più che viene fornito con il cuore, che sta bene e può essere cancellato dopo.
- a) Se il pesce contiene un marcatore fluorescente cardiaco come Tg (myl7: GFP) twu34, utilizzare la portata fluorescenti per la dissezione e verificare l'asportazione del cuore da parte fioritura (Figura 3).
- a) Una volta che il cuore è stato rimosso dalla cavità, usare le pinze per tenere il cuore e un micro-ago per rimuovere supplementari non tessuto cardiaco e la fodera epicardico dall'esterno del cuore.
I pesci più grandi (più grandi di 12mm SL):
- b) Utilizzando primavera trattati micro-forbici, fare tre incisioni di meno di 1 millimetro in profondità: 1 - taglio trasversale attraverso le branchie 2 - taglio trasversale al ventre anteriore 3 - taglio sagittale sul lato ventrale collega i due tagli (Figura 4).
- b) Utilizzando pinze taglienti rimuovere i muscoli pettorali e le pinne dal corpo di aprire la cavità del corpo e rivelare il tessuto argenteo del pericardio (Figura 5A). Rimuovere questo tessuto pericardico e il cuore diventa visibile (Figura 5B).
- b) Usare la micro-forbici per tagliare l'arteria collegata al bulbo arterioso, che si trova superiore al cuore. Una volta che questa arteria è tagliato, mettere le punte pinza sotto l'atrio, usare la pinza per raccogliere il cuore fuori della cavità. Se vi è il tessuto in più che viene fornito con il cuore, che va bene e può essere rimosso in seguito.
- b) Una volta che il cuore è stato rimosso dalla cavità, utilizzare le due pinze per tenere il cuore e rimuovere il tessuto in più, o un paio di pinze per tenere il cuore e un micro-ago per rimuovere extra, non tessuto cardiaco. Il rivestimento epicardici, evidenti dalla sua pigmentazione nera, può essere rimossa dall'esterno del cuore, se desiderato con delicatezza raschiando il tessuto.
3. Fotografia di cuori
- Preparare un 23g / l di agar nutriente piatto di Petri e coprire agar solidificato con PBS.
- Utilizzando le pinze, fare un bene in agar che permette al cuore di riposare l'orientamento desiderato per fotografare.
- REMOVe il cuore dal tubo di PCR tenendo la punta del bulbo con la pinza con decisione. Mettere il cuore nel piatto agar.
- Orientare il cuore in agar da fotografare. Il campione può essere ruotato dopo ogni immagine di tutti gli orientamenti possibili (Figura 6).
- Utilizzare il tempo di esposizione in testa leggera e breve per fotografare il cuore. Effettuare le regolazioni per la qualità della luce utilizzando l'esposizione necessaria per ottenere la migliore fotografia.
4. Rappresentante dei risultati:
Un esempio di ben sezionato pulito cuore è mostrato in più orientamenti in Figura 6. Ogni centro avrà alcune differenze nella morfologia generale, ma il cuore deve essere completa, contenente un ventricolo integro, atrio e bulbo arterioso. Alcuni esempi di questa variazione nella morfologia generale sono mostrati in figura 7. Il nero macchiato tessuto epicardico può anche strappare dal cuore.
Figura 1. Misurare il pesce dal muso al peduncolo caudale utilizzando una pinza digitale millimetri.
Figura 2. Tenere il pesce con una pinza tra gli occhi e le branchie.
Figura 3 A cardiaco specifico marcatore fluorescente transgenici come il Tg (myl7: GFP). Twu34, qui, può aiutare a visualizzare cuore sezionato da pesci più piccoli.
Figura 4 Tre incisioni per rimuovere i muscoli pettorali e la pelle: 1 - trasversalmente attraverso le branchie 2 - taglio trasversale al ventre anteriore 3 - taglio sagittale sul lato ventrale che collega entrambi i tagli..
. Lettere Figura 5 Black Label le camere del cuore: bulbo arterioso (ba), ventricolo (v), e l'atrio (a).
A-La cavità superiore del corpo è aperto per mostrare il tessuto argenteo del pericardio.
B-Dopo aver rimosso il pericardio, il cuore è visibile e facilmente rimovibile.
Orientamenti Figura 6. Differenti del cuore sono mostrati. Lettere nere etichetta le camere del cuore: bulbo arterioso (ba), ventricolo (v), e l'atrio (a). Grigio frecce indicano la posizione e l'orientamento del cuore in riferimento alla sua posizione normale del corpo: anteriore (A), posteriore (P), dorsale (D), ventrale (V), sinistro (L) e destro (R). Bar scala indica 400μm.
A-ventrale vista del cuore
B-dorsale vista del cuore
C-vista laterale dal lato sinistro
D-laterale vista dal lato destro
Figura 7. Morfologia dei cuori di diverse dimensioni è indicato. Lettere nere etichetta le camere del cuore: bulbo arterioso (ba), ventricolo (v), e l'atrio (a). Barra di scala indicato 400 micron.
AC-Hearts forma di pesce con meno di 12 millimetri SL
DF-Hearts forma di pesce con SL più grandi di 12mm
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Discussion
Questi metodi per la dissezione del cuore zebrafish di post-embrionale di pesce permette la rimozione completa di un cuore integro. Mentre questa tecnica è semplice e fornisce guide per tagli esterni che evitare di danneggiare il cuore, una mano ferma è essenziale per i più piccoli pesci.
Un passo fondamentale durante la dissezione è quello di identificare il pericardio argenteo come il cuore è direttamente all'interno di questa uscita. Visualizzando il pericardio fornisce un indicatore importante per la ricerca e, infine, rimuovere il modulo cuore della cavità del corpo. Inoltre, tagliando l'arteria superiore alla arterioso bulbo impedisce la rimozione accidentale del bulbo dal resto del cuore. Nelle grandi pesci a volte è necessario rimuovere la parte inferiore del corpo per mantenere il corpo testa e la parte superiore che contiene il cuore stabile durante la dissezione. Questo può essere fatto continuando il taglio inferiore trasversale attraverso le cavità del corpo e della colonna vertebrale con le forbici.
Dissezione del cuore zebrafish è non solo utile per studi simili alla nostra analisi maturazione, ma possono essere utili nello studio degli stati di malattia del pesce zebra, l'isolamento di RNA nel cuore, e in altre ricerche analitiche che utilizzano il cuore.
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Disclosures
Nessun conflitto di interessi dichiarati.
Acknowledgments
Grazie a Marie Birne, Areti Tsiola, Jaymie Estevez e Arelys Uribe. Questo lavoro è stato sostenuto in parte da CUNY Research Foundation e Howard Hughes Medical Institute programma estivo di sovvenzione per gli studenti universitari (SPUR) e NIH RO3 41702-00-01. La ricerca è stata sostenuta anche dal Queens College e alcuni degli esperimenti sono stati fatti su apparecchi dal Fondo Core for Imaging, Biologia Cellulare e Molecolare al Queens College.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Paraformaldehyde | EMD Millipore | PX0055 | .04g/mL in PBS |
| Forceps #55 | Fine Science Tools | 11295-51 | |
| Micro-scissors | Fine Science Tools | 15005-08 | |
| Pin holder | Fine Science Tools | 26016-12 | |
| Micro-needles | Fine Science Tools | 10130-10 | |
| Nutrient Agar | BBL | 11472 | 23g/L in distilled H2O |
| Petri dishes | BD Biosciences | 351029 | |
| PCR 8-tube strips | USA Scientific, Inc. | 1402-2500 | |
| Digital Caliper | Fisher Scientific | 14-648-17 |
References
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