Summary
Un método claro y estandarizado para la disección y el aislamiento del corazón del pez cebra en varias etapas de desarrollo se describen. Técnicas de anotación y cuantificación también se discuten.
Abstract
Pez cebra se han convertido en un organismo modelo beneficioso y práctico para el estudio del desarrollo embrionario del corazón (ver comentarios de los últimos 1-6), sin embargo, el trabajo de examen de post-embrionario a través del desarrollo adulto cardiaca se ha limitado 7.10. Examinar el cambio de morfología del corazón de maduración y el envejecimiento se ven limitadas por la falta de técnicas disponibles para la puesta en escena y el aislamiento de los corazones juveniles y adultos. Con el fin de analizar el desarrollo del corazón durante la vida útil del pescado, que diseccionan el corazón del pez cebra en varias etapas y una fotografía para su posterior análisis 11. Las características morfológicas del corazón puede ser cuantificado y corazones individuales pueden ser analizados por una serie de métodos estándar. Pez cebra crecen a tasas variables y la maduración se correlaciona mejor con el tamaño de los peces de la edad, por lo tanto, posterior a la fijación, longitud del pez fotografía y medida como un indicador de la maduración de los peces. Este protocolo se explican dos técnicas distintas, el tamaño de la disección dependientes de pez cebra, que van desde 3,5 mm de longitud estándar larvas (SL) con el corazón de la longitud del ventrículo 100μm (VL), a los adultos, con el SL de 30 mm y 1 mm de VL o más grande. Las larvas de peces y adultos tienen el cuerpo muy diferente y la morfología de órganos. Las larvas no sólo son significativamente más pequeños, tienen menos pigmento y cada órgano es visualmente muy difíciles de identificar. Por esta razón, utilizamos distintas técnicas de disección.
Se utilizó antes de la disección de los procedimientos de fijación, como hemos descubierto que el corazón disecado directamente después de la eutanasia tienen una morfología más variable, con el balón muy flojo y como aurículas en comparación con el corazón eliminado después de la fijación. Los peces fijo antes de la disección, mantener vivo en la morfología y la posición de la cámara (datos no mostrados). Además, para fines de demostración, nos aprovechamos del corazón (miocardio) específicos GFP transgénicos Tg (myl7: GFP) twu34 (12), que nos permite visualizar todo el corazón y es particularmente útil en las primeras etapas de desarrollo, cuando el corazón morfología es menos clara de los tejidos circundantes. La disección del corazón hace un mayor análisis de la biología celular y molecular que subyacen al desarrollo del corazón y la maduración utilizando hibridación in situ, inmunohistoquímica, la extracción de RNA o otros métodos analíticos más fácil en el post-embrionario del pez cebra. Este protocolo proporciona una técnica valiosa para el estudio de la maduración de desarrollo cardíaco y el envejecimiento.
Protocol
Pez cebra se plantearon a través de protocolos estándar de 13 en las instalaciones de animales Queens College a 28 ° C. Los distintos pares de pescado o apareamientos grupo debe ser preformado y los embriones resultantes limpian y se almacenan en una incubadora de 28 ° C. Salud de los peces deben ser examinados todos los días. En la fecundación después de 5 días (DPF), el pescado debe ser separada en los tanques, con una densidad de peces 10-15 y entró en la guardería instalación de pescado. Para que el protocolo que aquí se presenta el pez cebra se recogieron en larva a través de las etapas adultas: 15, 30, 45, 60, 90, 180 DPF.
1. Pez cebra colección tema y la fijación
- Retire el pescado del tanque de hábitat por medio de net y el lugar en el 0,2% tricaína para anestesiar.
- Coloque el pescado anestesiado en agua helada durante 15 minutos para practicar la eutanasia.
- Hacer paraformaldehido fresco 4% (PFA) en 1x de tampón fosfato salino (PBS).
- Incubar peces recogidos en PFA al 4% durante 1-2 horas a temperatura ambiente durante la noche a 4 ° C en una placa de Petri envuelto en parafilm. Esto mantiene el piso de peces y más tarde hace una disección mucho más fácil.
- Después de la fijación, lavar dos veces en PBS con Tween (PBT). El pescado puede ser tener en PBT a 4 ° C durante un máximo de 10 días.
2. Medición de los peces y la disección
- Coloque el pescado en una sola media placa de Petri llena de PBS y lo pondré sobre su lado derecho.
- Medir la longitud de los peces del hocico a la base de la cola (el pedúnculo caudal), sin incluir las aletas de la cola, utilizando un calibrador digital, mm (Figura 1). Esta es la longitud estándar (SL).
- Cada pez se le puede asignar un número / combinación de letras para permitir que un pez y el corazón como consecuencia disecados para realizar un seguimiento para su posterior análisis. Datos, incluyendo el número de acciones de los padres, edad en la fijación, las mediciones de SL, se introdujeron en una hoja de cálculo y organizada sobre la base de estas etiquetas.
- Antes de la disección, la etiqueta tiras de tubos PCR con número de seguimiento asignado y se llenan de PBT u otra solución apropiada para su posterior análisis.
- Orientar a los peces ventral hacia arriba en la placa de Petri, mientras que la estabilización del cuerpo con pinzas de sujeción de la cabeza entre los ojos y las agallas (Figura 2).
Los peces más pequeños (menores de 12 mm SL):
- a) El uso de pinzas cortantes, o una micro-aguja en un soporte de pasador, quitar los músculos pectorales y las aletas del cuerpo para revelar el corazón. El constante movimiento de la pinza durante la disección puede causar corrientes en el PBT que se mueven los peces. Esto es particularmente problemático para los peces más pequeños, por lo tanto una micro-aguja se puede utilizar para eliminar los músculos pectorales y las aletas y abrir la cavidad del cuerpo.
- a) utilizar con cuidado las pinzas para sacar el corazón de la cavidad de debajo de la aurícula. Alternativamente, en algunos peces que puede ser capaz de extraer el corazón, tirando suavemente hacia fuera con bulbo y el resto del corazón seguirá. Tenga cuidado con la ubicación de la aurícula si se utiliza esta técnica, ya que pueden dañarse fácilmente. Si hay tejido extra que viene con el corazón, que está muy bien y pueden ser eliminados después.
- a) Si el pescado contiene un marcador fluorescente cardiacas como Tg (myl7: GFP) twu34, usar un ámbito de fluorescentes para la disección y verificar la extracción del corazón por el florecimiento (Figura 3).
- a) Una vez que el corazón se retira de la cavidad, utilice las pinzas para mantener el corazón y una micro-aguja para extraer adicional no tejido cardíaco y la pared epicárdica de la parte exterior del corazón.
Los peces más grandes (más de 12 mm SL):
- b) Utilización de la primavera maneja micro-tijeras, hacen tres incisiones de menos de 1mm de profundidad: 1 - corte transversal a través de los dos branquias - corte transversal en el vientre anterior 3 - corte sagital en el lado ventral de conectar los dos cortes (Figura 4).
- b) El uso de pinzas afiladas eliminar los músculos pectorales y las aletas del cuerpo para abrir la cavidad del cuerpo y revelar el tejido plateado del pericardio (Figura 5). Eliminar este tejido de pericardio y el corazón se vuelve visible (Figura 5).
- b) Utilice las tijeras para cortar micro-la arteria conectada al bulbo arterioso, que se encuentra superior a la del corazón. Una vez que esta arteria se corta, se puso las puntas de unas pinzas en el atrio, utilice las pinzas para sacar el corazón de la cavidad. Si hay tejido extra que viene con el corazón, que está muy bien y se puede quitar más tarde.
- b) Una vez que el corazón se retira de la cavidad, use las dos pinzas para mantener el corazón y retirar el tejido extra, o un par de pinzas para mantener el corazón y una micro-aguja para extraer extra, no de tejido cardíaco. El revestimiento epicárdica, evidente por su pigmentación negro, puede ser removido de la parte exterior del corazón, si lo desea, raspando suavemente en el tejido.
3. Fotografía de los corazones
- Prepare una 23g / L de agar nutritivo plato de Petri y la cubierta de agar solidificado con PBS.
- Usando las pinzas, hacer un pozo en el agar que permite que el corazón descanse en la orientación deseada para la fotografía.
- Remove el centro del tubo de PCR mediante la celebración de la punta del bulbo con las pinzas con firmeza. Coloque el corazón en el plato de agar.
- Orientar el corazón en agar para fotografiar. La muestra se puede girar después de cada imagen para todas las orientaciones posibles (Figura 6).
- Utilice el tiempo de exposición aérea ligeros y cortos para fotografiar el corazón. Haga los ajustes de calidad de la luz con la exposición como sea necesario para obtener la mejor fotografía.
4. Los resultados representativos:
Un ejemplo de un corazón bien diseccionado limpia se muestra en múltiples orientaciones en la Figura 6. Cada centro tendrá algunas diferencias en la morfología general, pero el corazón debe ser completa, que contiene un ventrículo intacto, el atrio y bulbo arterioso. Algunos ejemplos de esta variación en la morfología general se muestra en la Figura 7. El negro manchado tejido epicárdico puede arrancar del corazón.
Figura 1. Medir el pescado desde el hocico hasta el pedúnculo caudal con una pinza digitales mm.
Figura 2. Sostenga el pescado con una pinza entre los ojos y agallas.
Figura 3 cardiaco específico marcador fluorescente transgénicos como Tg (myl7: GFP). Twu34, se muestra aquí, puede ayudar en la visualización de los corazones disecados de los peces más pequeños.
Figura 4 Tres incisiones para eliminar los músculos pectorales y la piel: 1 - corte transversal a través de las branquias 2 - corte transversal en el vientre anterior 3 - corte sagital en el lado ventral de conectar los dos cortes..
. Cartas de la figura 5 Negro etiqueta de las cámaras del corazón: bulbo arterioso (bis), en el ventrículo (V), y el atrio (a).
A-La cavidad del cuerpo superior está abierta para mostrar el tejido plateado del pericardio.
B-Después de retirar el pericardio, el corazón es visible y fácil de retirar.
Orientaciones Figura 6. Diferentes del corazón se muestran. Letras en negro etiqueta de las cámaras del corazón: bulbo arterioso (bis), en el ventrículo (V), y el atrio (a). Flechas grises indican la ubicación y orientación del corazón, en referencia a su posición normal en el cuerpo: anterior (A), posterior (P), dorsal (D), ventral (V), izquierda (L) y derecha (R). Barra de escala indica 400μm.
A-ventral vista del corazón
B-vista dorsal del corazón
C-vista lateral del lado izquierdo
D-vista lateral del lado derecho
Figura 7. Morfología de los corazones de diferentes tamaños se muestra. Letras en negro etiqueta de las cámaras del corazón: bulbo arterioso (bis), en el ventrículo (V), y el atrio (a). Barra de escala se indica 400 micras.
AC-Corazones forma de pez con menos de 12 mm SL
DF-Corazones con forma de pez SL mayor que 12 mm
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Discussion
Estos métodos para la disección del corazón del pez cebra de post-embrionario de peces permite la extirpación completa de un corazón en buen estado. Si bien esta técnica es sencilla y ofrece guías para los cortes externos que evitar que se dañe el corazón, una mano firme es esencial para los peces más pequeños.
Un paso clave en la disección es identificar el pericardio plateado como el corazón está directamente dentro de este saco. Visualizar el pericardio proporciona un marcador importante para la búsqueda y en última instancia, la eliminación de la forma del corazón de la cavidad corporal. Además, el corte de la arteria superior a la de bulbo arterioso evitará la eliminación accidental de los bulbos del resto del corazón. En los peces más grandes a veces es necesario quitar la parte inferior del cuerpo para mantener el cuerpo principal y superior que contiene el corazón estable durante la disección. Esto se puede hacer mediante la continuación del corte transversal inferior a través de la cavidad del cuerpo y la columna vertebral con unas tijeras.
La disección del corazón del pez cebra no sólo es útil para estudios similares en nuestro análisis de la maduración propia, pero puede ser útil en el estudio de los estados de la enfermedad del pez cebra, el aislamiento de ARN en el corazón, y en la investigación analítica utilizando el corazón.
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Disclosures
No hay conflictos de interés declarado.
Acknowledgments
Gracias a Marie Birne, Tsiola Areti, Estévez Jaymie y Arelys Uribe. Este trabajo fue apoyado en parte por la Fundación de Investigación de CUNY y Howard Hughes Medical Institute Programa de Verano de becas para estudiantes de pregrado (SPUR) y NIH SR3 41702-00-01. La investigación también fue apoyada por el Queens College y algunos de los experimentos se realizaron en el equipo del Fondo para el núcleo de la Imagen, Biología Celular y Molecular de la Universidad de Queens.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Paraformaldehyde | EMD Millipore | PX0055 | .04g/mL in PBS |
| Forceps #55 | Fine Science Tools | 11295-51 | |
| Micro-scissors | Fine Science Tools | 15005-08 | |
| Pin holder | Fine Science Tools | 26016-12 | |
| Micro-needles | Fine Science Tools | 10130-10 | |
| Nutrient Agar | BBL | 11472 | 23g/L in distilled H2O |
| Petri dishes | BD Biosciences | 351029 | |
| PCR 8-tube strips | USA Scientific, Inc. | 1402-2500 | |
| Digital Caliper | Fisher Scientific | 14-648-17 |
References
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