Summary
En tydlig och standardiserad metod för dissekering och isolering av zebrafisk hjärtat på flera utvecklingsstadier beskrivs. Annotering och kvantifiering tekniker diskuteras också.
Abstract
Zebrafisk har blivit en positiv och praktisk modell organism för studier av embryonala hjärtat utveckling (se guide 1-6), men arbetet undersöka post-embryonala genom vuxen hjärt utveckling har varit begränsade 7-10. Undersöka ändra morfologi mogna och åldrande hjärta begränsas av bristen på tekniker för mellanstationer och isolera unga och vuxna hjärtan. För att analysera hjärtats utveckling under fiskens livscykel, dissekera vi zebrafisk hjärtan på flera stadier och fotografera dem för vidare analys 11. Den morfologiska funktioner i hjärtat kan lätt kvantifieras och enskilda hjärtan kan analyseras ytterligare genom en mängd standardmetoder. Zebrafisk växa till rörlig ränta och mognad korrelerar bättre med fisk storlek än ålder, alltså efter fixering, vi fotograferar och mäta fisk längd som en mätare av fisk mognad. Detta protokoll förklarar två olika, storlek beroende dissektion tekniker för zebrafisk, allt från larver 3,5 mm standard längd (SL) med ett hjärta av 100μm ventrikeln längd (VL), för vuxna, med SL i 30mm och VL 1 mm eller större. Larver och vuxen fisk har helt olika kropp och orgel morfologi. Larver är inte bara betydligt mindre, de har mindre pigment och varje organ är visuellt mycket svårt att identifiera. Av denna anledning använder vi olika dissektion tekniker.
Vi använde före dissektion förfaranden fixering, eftersom vi upptäckt att hjärtan dissekeras direkt efter euthanization har en mer varierande morfologi, med mycket lös och ballong som förmak jämfört med hjärtan bort efter fixering. Fisken fasta före dissektion, behålla in vivo morfologi och kammare ställning (data visas inte). Dessutom, för demonstration tar vi nytta av hjärtat (hjärtinfarkt) särskilda GFP transgena Tg (myl7: GFP) twu34 (12), som tillåter oss att visualisera hela hjärtat och är särskilt användbart i tidiga stadier i utvecklingen när hjärt- morfologi är mindre skiljer sig från omgivande vävnader. Dissektion av hjärtat ger ytterligare analys av cell-och molekylärbiologi underliggande hjärt utveckling och mognad med in situ hybridisering, immunohistokemi, RNA-extraktion eller andra analysmetoder lättare i post-embryonal zebrafisk. Detta protokoll kommer att ge en värdefull teknik för att studera hjärtats utveckling mognad och åldrande.
Protocol
Zebrafisk höjdes med standardprotokoll 13 i Queens College Djuranläggningen vid 28 ° C. Enskilda fiskar par eller parningar grupp bör vara förformade och den resulterande embryona rengöras och lagras i ett 28 ° C inkubator. Fisk hälsa bör undersökas dagligen. Vid 5-dagars efter befruktning (DPF), bör fisk delas in i tankar vid en 10-15 fiskar täthet och trädde i fisken anläggningen barnkammaren. För protokollet presenteras här zebrafisk samlades in vid larv genom vuxna stadier: 15, 30, 45, 60, 90, 180 DPF.
1. Zebrafisk ämne insamling och fixering
- Ta bort fisk från habitat tanken med nät och placera den i 0,2% Tricaine att söva.
- Placera sövda fisk i isvatten i 15 minuter för att avliva.
- Gör färska 4% paraformaldehyd (PFA) i 1x fosfatbuffrad saltlösning (PBS).
- Inkubera in fisken i 4% PFA i 1-2 timmar vid RT därefter över natten vid 4 ° C i en petriskål insvept i parafilm. Detta håller fisken plant och gör senare dissektion mycket lättare.
- Efter fixering, skölj två gånger i PBS med Tween (PBT). Fisk kan hålla i PBT vid 4 ° C i upp till 10 dagar.
2. Mätning av fisk och dissektion
- Placera enda fisken i petriskål halv fyllda med färska PBS och lägg det på dess högra sida.
- Mät längden av fisk från nos till svansrot (den bakre stjälk), exklusive svans fenor, med hjälp av en digital mm tjocklek (figur 1). Detta är den standard längden (SL).
- Varje fisk kan tilldelas ett nummer / bokstavskombination för att möjliggöra en individuell fisk och den resulterande dissekerade hjärta att spåras för senare analys. Data, inklusive föräldrarnas lager antal, ålder vid fixering, SL mätningar infördes i ett kalkylblad och organiserad utifrån dessa etiketter.
- Före dissektion, etikett PCR-rör strips med tilldelade spårningsnummer och fyll med PBT-eller annan lösning som är lämplig för vidare analys.
- Orient fisken ventrala sidan uppåt i petriskål samtidigt stabilisera kroppen med pincett hålla huvudet mellan ögonen och gälarna (figur 2).
Mindre fisk (mindre än 12mm SL):
- a) Med vassa pincett eller en mikro-nål i en nål hållare, ta bort bröstmusklerna och fenor från kroppen för att avslöja hjärtat. Den ständiga rörelse pincett under dissektionen kan orsaka strömmar i PBT att flytta fisken. Detta är särskilt problematiskt för mindre fisk, alltså en mikro-nål kan användas för att avlägsna bröstmusklerna och fenor och öppna kroppen hålighet.
- a) försiktigt använda pincett för att ösa hjärtat ur hålrummet från under atrium. Alternativt, i vissa fiskar du kanske kan ta bort hjärtat genom att försiktigt dra den uppsvällda ut och resten av hjärtat kommer att följa. Var försiktig med placeringen av atrium om du använder den här tekniken eftersom den kan lätt skadas. Om det finns extra vävnad som kommer med hjärtat, det är bra och kan rensas efter.
- a) Om fisken innehåller en fluorescerande hjärtmarkör exempelvis Tg (myl7: GFP) twu34 använder fluorescerande utrymme för dissekering och kontrollera borttagning av hjärtat genom BLOMNINGSTID (Figur 3).
- a) När hjärtat tas bort från hålighet använder pincett för att hålla hjärtat och en mikro-nål för att ta bort extra icke-hjärtvävnad och epicardial foder från utsidan av hjärtat.
Större fiskar (större än 12mm SL):
- b) med Spring hanteras mikro-sax, gör tre snitt på mindre än 1 mm djup: 1 - tvären genom gälarna 2 - tvären vid främre buken 3 - sagittal snitt på ventralsidan ansluta både skär (Figur 4).
- b) Med vassa pincett bort bröstmusklerna och fenor från kroppen för att öppna kroppens hålrum och avslöja den silverglänsande vävnad av hjärtsäck (Figur 5A). Ta bort denna perikardiell vävnad och hjärtat kommer att bli synlig (Figur 5B).
- b) Använd mikro-sax för att klippa artären ansluten till uppsvällda arteriosus, som ligger bättre till hjärtat. När denna pulsåder skärs lade pincett tips under atrium, använd pincett att ösa hjärtat ur kaviteten. Om det finns extra vävnad som kommer med hjärtat, det är bra och kan tas bort senare.
- b) När hjärtat tas bort från hålighet, använda de två pincett för att hålla hjärtat och ta bort extra vävnad eller en pincett för att hålla hjärtat och en mikro-nål för att ta bort extra, icke-hjärtvävnad. Den epicardial foder, framgår av dess svarta pigment, kan tas bort från utsidan av hjärtat om så önskas genom att försiktigt skrapa vävnad.
3. Fotografering av hjärtan
- Förbered en 23g / L näringsagar petriskål och täck stelnat agar med PBS.
- Med hjälp av pincett, gör en bra i agar som gör att hjärtat att vila i önskad riktning för fotografering.
- Avtagbare hjärtat från PCR-röret genom att hålla spetsen på bulbous med pincett ordentligt. Placera hjärtat i agar skålen.
- Orient hjärtat i agar att fotografera. Provet kan roteras efter varje bild för alla möjliga inriktningar (Figur 6).
- Använd överljus och kort exponeringstid för att fotografera hjärtan. Göra justeringar för ljuskvalitet med exponeringen som krävs för att få den bästa bilden.
4. Representativa resultat:
Ett exempel på en väl dissekeras rent hjärta visas i flera inriktningar i Figur 6. Varje hjärta kommer att ha några skillnader i totala morfologi, men hjärtat ska vara klar med en intakt ventrikeln, atrium och kupig arteriosus. Några exempel på denna variation i den totala morfologi visas i figur 7. Den svarta prickiga epicardial vävnad kan också bort från hjärtat.
Figur 1. Mät fisken från nos till stjärt stjälk hjälp av en digital mm skjutmått.
Figur 2. Håll fisken med pincett mellan ögonen och gälarna.
Figur 3 En hjärt specifik fluorescerande transgena markör som Tg (myl7: GFP). Twu34, som visas här, kan stöd i att visualisera hjärtan skäras ut från mindre fiskar.
Figur 4 Tre snitt för att ta bort bröstmusklerna och hud: 1 - tvären genom gälarna 2 - tvären vid främre buken 3 - sagittal snitt på ventralsidan koppla både nedskärningar..
. Figur 5 svarta bokstäver märka hjärtats kamrar: bulbous arteriosus (BA), kammare (v), och Atrium (a).
A-Den övre kroppen hålighet är öppen för att visa den silverfärgade vävnaden i hjärtsäcken.
B-Efter att hjärtsäcken, är hjärtat synlig och lätt tas bort.
Figur 6. Olika inriktningar av hjärtat visas. Svarta bokstäver märka hjärtats kamrar: bulbous arteriosus (BA), kammare (v), och Atrium (a). Grå pilar indikerar läge och orientering av hjärtat med hänvisning till sin normala plats i kroppen: främre (A), bakre (P), rygg (D), ventrala (V), vänster (L) och höger (R). Skala stapeln indikerar 400μm.
A-ventrala bild av hjärtat
B-rygg bild av hjärtat
C-lateral vy från vänster sida
D-lateral vy från höger
Figur 7. Morfologi av hjärtan i olika storlekar visas. Svarta bokstäver märka hjärtats kamrar: bulbous arteriosus (BA), kammare (v), och Atrium (a). Skala bar anges 400 ìm.
AC-Hearts formen fisk med SL mindre än 12mm
DF-Hearts formen fisk med SL större än 12mm
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Dessa metoder för dissekering av zebrafisk hjärtat av post-embryonala fisk möjliggör fullständig borttagning av ett oskadat hjärta. Även om denna teknik är enkel och ger riktlinjer för extern nedskärningar som förhindrar skador på hjärtat, är en stadig hand viktigt för mindre fiskar.
Ett viktigt steg under dissektionen är att identifiera de silverfärgade hjärtsäcken som hjärtat är direkt inom detta SAC. Visualisera hjärtsäck är en viktig markör för att hitta och slutligen ta bort hjärtat utgör kroppens hålrum. Vidare kommer skära artären överlägsen den uppsvällda arteriosus förhindra oavsiktlig borttagning av bulbous från resten av hjärtat. I större fiskar är det ibland nödvändigt att ta bort den nedre delen av kroppen för att hålla huvud och överkropp med hjärtat stabil under dissektion. Detta kan göras genom att fortsätta den lägre tvärsnitt genom kroppen hålrum och ryggraden med sax.
Dissekering av zebrafisk hjärta är inte bara användbar för liknande studier för att vår egen mognad analys, men kan vara användbar i studiet av sjukdomstillstånd i zebrafisk, RNA isolering i hjärtat, och i andra analytisk forskning utnyttja hjärtat.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Inga intressekonflikter deklareras.
Acknowledgments
Tack vare Marie Birne, Areti Tsiola, Jaymie Estevez och Arelys Uribe. Detta arbete stöddes delvis av CUNY Research Foundation och Howard Hughes Medical Institute Grant sommarskola för studenter (SPUR) och NIH RO3 41702-00-01. Forskning stöddes också av Queens College och några av experimenten gjordes på utrustning från Core Facility for Imaging, Cell-och molekylärbiologi vid Queens College.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Paraformaldehyde | EMD Millipore | PX0055 | .04g/mL in PBS |
| Forceps #55 | Fine Science Tools | 11295-51 | |
| Micro-scissors | Fine Science Tools | 15005-08 | |
| Pin holder | Fine Science Tools | 26016-12 | |
| Micro-needles | Fine Science Tools | 10130-10 | |
| Nutrient Agar | BBL | 11472 | 23g/L in distilled H2O |
| Petri dishes | BD Biosciences | 351029 | |
| PCR 8-tube strips | USA Scientific, Inc. | 1402-2500 | |
| Digital Caliper | Fisher Scientific | 14-648-17 |
References
- Ahmad, N., Long, S., Rebagliati, M. A southpaw joins the roster: the role of the zebrafish nodal-related gene southpaw in cardiac LR asymmetry. Trends Cardiovasc Med. 14, 43-49 (2004).
- Armstrong, E. J., Bischoff, J. Heart valve development: endothelial cell signaling and differentiation. Circ Res. 95, 459-470 (2004).
- Bakkers, J., Verhoeven, M. C., Abdelilah-Seyfried, S. Shaping the zebrafish heart: from left-right axis specification to epithelial tissue morphogenesis. Dev Biol. 330, 213-220 (2009).
- Glickman, N. S., Yelon, D. Cardiac development in zebrafish: coordination of form and function. Semin Cell Dev Biol. 13, 507-513 (2002).
- Heicklen-Klein, A., McReynolds, L. J., Evans, T. Using the zebrafish model to study GATA transcription factors. Semin Cell Dev Biol. 16, 95-106 (2005).
- Schoenebeck, J. J., Yelon, D. Illuminating cardiac development: Advances in imaging add new dimensions to the utility of zebrafish genetics. Semin Cell Dev Biol. 18, 27-35 (2007).
- Beis, D. Genetic and cellular analyses of zebrafish atrioventricular cushion and valve development. Development. 132, 4193-4204 (2005).
- Lepilina, A. A dynamic epicardial injury response supports progenitor cell activity during zebrafish heart regeneration. Cell. 127, 607-619 (2006).
- Wills, A. A., Holdway, J. E., Major, R. J., Poss, K. D. Regulated addition of new myocardial and epicardial cells fosters homeostatic cardiac growth and maintenance in adult zebrafish. Development. 135, 183-192 (2008).
- Parichy, D. M., Elizondo, M. R., Mills, M. G., Gordon, T. N., Engeszer, R. E. Normal table of postembryonic zebrafish development: staging by externally visible anatomy of the living fish. Dev Dyn. 238, 2975-3015 (2009).
- Huang, C. J., Tu, C. T., Hsiao, C. D., Hsieh, F. J., Tsai, H. J. Germ-line transmission of a myocardium-specific GFP transgene reveals critical regulatory elements in the cardiac myosin light chain 2 promoter of zebrafish. Dev Dyn. 228, 30-40 (2003).
- Westerfield, M. The Zebrafish Book, A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio). , University of Oregon Press. (1995).
