Summary
형광단 개발 및 이미징 기술, 바이러스가 바이러스와 세포 사이의 초기 상호 작용을 시각화하기 위해 고안되었다 뎅그열의 알렉사 플루어 라벨링의 간단한 방법에있는 발전을 활용.
Abstract
바이러스와 세포 사이의 상호 작용의 초기 이벤트는 감염의 결과에 지대한 영향을 가질 수 있습니다. 이 상호 작용에 영향을 미치는 요인을 결정하는 것은 질병 pathogenesis 개선 이해로 이어질 때문에 예방이나 치료 설계에 영향을 미칠 수 있습니다. 따라서,이 상호 작용을 조사하는 방법의 개발이 유용할 것입니다. fluorophores 개발 1-3 및 이미징 기술 4 최근 발전은 뎅그열 pathogenesis에 대한 현재의 지식을 개선하기 때문에 매년 발생하는 뎅그열 감염의 수백만을 줄이기 위해 방법을 포장에 이용하실 수 있습니다.
싸여 뎅그열 바이러스는 단일 가닥 RNA 긍정적인 게놈 5가 들어있는 nucleocapsid 껍질을 보호 90 봉투 당단백질 (E) dimers 구성된 외부 비계를 타고있다. 바이러스 표면에 동일한 단백질 subunits 따라서 아민 반응 염료로 분류하고 immunofluorescent 현미경을 통해 시각 수 있습니다. 여기, 우리는 알렉사 플루어 succinimidyl 에스테르 염색가 라벨 후 높은 가능한 바이러스를 굴복 나트륨 중탄산염 버퍼에 직접 용해와 뎅그열 바이러스의 라벨링의 간단한 방법을 제시한다. 라이브 바이러스 및 단백질 라벨은 보통 디메틸 sulfoxide의 색소의 reconstitution을 필요로 기존 제조 업체의 프로토콜의 라벨에 대한 표준화된 절차가 없습니다. 디메틸 sulfoxide의 존재, 심지어 분 수량에 바이러스의 생산 감염을 차단하고 또한 세포 세포 독성 6 유발 수 있습니다. 이 프로토콜의 디메틸 sulfoxide의 사용의 배제 따라서이 가능성을 감소. 알렉사 플루어의 염료가 우수한 photostability을 가지고 있으며 세포 이해와 바이러스의 endosomal 교통 연구에 이상적, 낮은 산도에 민감한 등 플루오레신와 rhodamine이 같은 일반적인 염료보다됩니다. 알렉사 플루어 염료의 활용은 바이러스 특정 항체 및 호스트 세포 7의 putative 수용체에 의해 표시 뎅그열 바이러스의 인식에 영향을주지 않았다. 이 방법은 virological 공부에 유용한 응용 프로그램을 수 있습니다.
Protocol
1. 뎅그열 바이러스의 알렉사 플루어 라벨링
- 라벨 반응하기 전에, 자당 쿠션과 뎅그열 바이러스를 정화하고 같은 프로토콜에 표시된 필요한 시약과 장비를 준비합니다.
- 라벨 및 필터 주사기 0.2μm 필터를 소독 바로 앞에 신선한 0.2M 나트륨 중탄산염 버퍼, pH를 8.5 (라벨 버퍼) 및 히드록 실 아민 1.5M 버퍼, 산도 8.3을 (시약을 중지) 준비합니다.
- 2ml 튜브에 버퍼를 라벨링의 1ml에 뎅그열 바이러스를 정화 약 3x10 8 플라크 형성 단위 (pfu)를 희석. 이것은 바이러스의 일괄 라벨에 대한 비례까지 확장할 수 있습니다.
- Reconstitute 동결 건조된 알렉사 플루어 594 (AF594) 전에 라벨 반응 즉시 버퍼를 라벨에 1mM로 succinimidyl 에스테르. 알렉사 플루어 염료 시리즈에서 다른 fluorochromes 하나의 필요에 따라 사용할 수 있습니다. 이 단계 이후 조명에 노출을 최소화합니다.
- 피펫 팁로 부드럽게 교반하면서 희석 바이러스에 1mM AF594 염료의 100μl를 추가합니다.
- 어둠 속에서 1 시간을 위해 실내 온도에서 상표 반응 믹스를 품어. 부드러운 뒤집어 모든 15mins로 섞는다.
- 테이블탑 원심 분리기에서 튜브 잠시 돌려 및 피펫 팁로 부드럽게 교반하면서 반응 혼합물을 중지 시약의 100μl를 추가합니다.
- 어둠 속에서 추가 시간 동안 실온에서 품어. 부드러운 뒤집어 모든 15mins로 섞는다.
2. 퓨리화잉 알렉사 플루어는 뎅그열 바이러스를 분류
- 그 동안에, 선택의 버퍼와 정화 열 평형. 본 실험에서는 PD - 10 컬럼 HNE 버퍼의 25ml (5mM Hepes, 150mM NaCl, 0.1mM EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산)), 사용하기 전에 산도 7.4과 equilibrated 있습니다.
- 칼럼의 맨 위에 표시된 바이러스를 적용하고 표시된 바이러스가 매트릭스를 입력 한때를 통해 흐름을 모으기 시작합니다. 모든 레이블이 붙은 바이러스가 매트릭스를 입력한 후에는 HNE 버퍼로 열을 채웁니다. 흐름을 통해 첫 2.5ml를 버리고 표시된 바이러스 분율의 다음 2ml를 수집합니다.
- -80에서 AF594 표시 뎅그열 바이러스를 정화 나누어지는하고 저장 ° C, 거리 광원에서.
- 한 나누어지는를 해동 및 레이블 바이러스의 배치를 사용하기 전에 상패 분석에 의해 표시된 바이러스의 titer를 결정한다.
- 감염 전에 잘 하루의 하단에 coverslip과 4 잘 판에서 M - 199 성장 매체 재배 종자 베로 세포의 5x10 4 당 음,.
- 37 우물에 문화의 표면에 뜨는를 제거하고 10 분 대한 100μl 볼륨 (필요에 따라 M - 199 유지 보수 매체 희석)에 표시 바이러스 1 감염의 다중성으로 세포를 감염 ° C.
- inoculums를 제거하고 1xPBS에 두 coverslips 씻으십시오.
- 30 분 3 %의 paraformalydehyde에있는 세포를 수정.
- 1xPBS에 coverslips 3 번 씻으십시오.
- 30 분 대한 1xPBS에서 0.1 %의 사포닌 및 5 % BSA가 포함된 permeabilization 솔루션 세포 Permeabilize.
- 로 세포를 품어 undiluted 원심 분리 - 명확히, 습기 챔버에서 1 시간에 대한 단클론 항체 3H5의 하이 브리 도마 문화 뜨는 빛으로부터 보호.
- (1xPBS는 1mM의 염화칼슘, 1mM 마그네슘 염화물 및 0.1 %의 사포닌을 포함) 씻어 버퍼에 coverslips 3 번 씻으십시오.
- AF488 안티 - 마우스 IgG 항체와 세포를 품어, 1:100은 빛으로부터 보호 습한 실내에 45mins를위한, permeabilization 솔루션 희석.
- 세척 버퍼에 coverslips 3 번 씻고 탈이온수에 한 번 씻어.
- DAB 8μl Mowiol 4-88 포함된 2.5 %의 Dabco로 초과 물을 배수하고 유리 슬라이드에 마운트 종이 타월에 대한 coverslip의 가장자리.
- 자이스 혈구 공촛점 현미경을 사용하여 볼 전에 4 하룻밤 설정 장착 솔루션 ° C를 허용합니다. 순차 인수는 concomitantly 감지기 사이의 시간과 스위칭에 흥미로운 한 형광단을 수행하여야한다.
- 이미지는 다음 라벨의 정도를 추정하기 위해 자이스 혈구 LSM 선 (禅) 소프트웨어를 사용하여 표시된 바이러스와 E 단백질 항체 얼룩의 공동 지방화에 대해 분석하고 있습니다.
3. 대표 결과
AF594 염색으로 표시 뎅그열 바이러스의 수율의 예제는 그림 2에 표시됩니다. 일반적으로 초기 titer 10 배 드롭 미만은 성공적인 라벨링 다음과 같은 관찰해야합니다. 그러나, 모든 버퍼가 성공하고 그들이 수성 솔루션 8 nonreactive 무료 지방산으로 hydrolyze로 알렉사 플루어 succinimidyl의 에스테르가 reconstitution 즉시 사용해야 라벨에 대한 신선한 준비하는 것을인지해야합니다.
다음, 라벨이 바이러스는 실험에 사용하기 전에 충분한 형광 검사되어야한다. 간단한 immunofluorescence 분석은 베로 세포에서 수행되었으며 라벨의 정도는 안티 - E 단백질 항체 얼룩으로 표시된 바이러스의 공동 지방화의 추정 수 있습니다. 끊다앨 세포 검사되었으며 전형적인 공촛점 이미지가 그림 3에 표시됩니다. virions 약 65-80%이 염료와 함께 레이블 것을 제안, 0.65에서 0.8에 이르기까지 계수를 중복 보여주 LSM 선종 소프트웨어를 사용하여 이미지의 공동 지방화 분석.
그림 1.Overall 체계는 뎅그열 바이러스 절차의 알렉사 플루어 염료 라벨을 묘사한. 첫째, 해당 버퍼 및 정화 뎅그열 바이러스가 준비하고 있습니다. 알렉사 플루어 염료는 재구성하고 버퍼를 라벨에 희석 뎅그열 바이러스에 추가됩니다. 반응은 다음 중지 시약의 추가 1 시간 후에 중지됩니다. 이후, 레이블 바이러스 무료 염료를 제거하는 크기 제외 칼럼을 통해 정화됩니다. 마지막으로, 표시된 바이러스는 플라크의 분석에 의해 다시 titrated와 형광을위한 테스트입니다.
그림 2. 로 AF594 분류 전후 상패 분석 결정 가능한 virions (pfu / ML)의 번호를 의미합니다. AF594 표시 뎅그열 바이러스의 나누어지는는 해동 후 다시 titrated 상패 분석에 의해 그것은 일반적으로 이하의 10 배 드롭로부터 표시합니다 시작 titer. 오류 막대는 중복의 표준 편차를 나타냅니다.
그림 3. 이전 일 coverslips에 성장 베로 세포에서 뎅그열 바이러스 E 단백질과 AF594 레이블의 공동 지방화. 전지는 37 10 분 1 뫄에서 AF594 표시된 뎅그열 감염된 ° C. 세포는 그 후에 고정 및 안티 - E 항체로 분류하고, E 단백질의 colocalization (녹색) 및 AF594 라벨 (적색)을 검사했다. 형광 신호는 자이스 혈구 LSM 710 공촛점 현미경을 사용하여 63X 배율에 따라 시각되었습니다. 스케일 바 10μm이다. 삽입된 페이지의 그림과 같이 노란색은 colocalization의 영역을 나타냅니다.
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Discussion
AF594 염료가이 보고서에 사용했지만, 알렉사 플루어 succinimidyl의 에스테르 시리즈 fluorophores 다양한 유사한 상표 화학 사용할 수 있습니다. 이 영상 이외 라벨 응용 프로그램을 확장할 수 있습니다. 유동세포계측법는 흥분과 외과 기계가 감지할 수 fluorophores에 대한 상표의 정도를 계산하는 공촛점 현미경의 대안으로 사용할 수 있습니다.
알렉사 플루어의 염료는 무료 아미노 그룹, 주로 아르기닌과 리신 9 정상적으로 바깥쪽 단백질 잔류물을 마주와 반응 작은 분자 수 있습니다. 알렉사 플루어 594 염료의 100μM과 뎅그열 바이러스 우리의 실험실, 활용에서 바이러스 titer에서 최소한의 손실과 이미지에 대한 충분한 밝기를 제공했습니다. 다른 밝기는 사용 염료의 농도를 변화하여 얻을 수 있습니다. 그러나, 염료 농도를 증가하는 것은 바이러스 생존 7,10를 줄일 수 있습니다. 한 가지 제한 fluorophores에 의해 접근 봉쇄에 의한 수용체의 바인딩에 간섭이다. 따라서, 응용 프로그램에 따라, 상표의 최적 수준 분류 및 기능 abrogation10의 정도 사이의 균형을 보장하기 위해 결정되어야합니다. 농도도 알렉사 플루어 succinimidyl의 에스테르 8 포스트 패키징 반응에 의해 영향을받을 수 있습니다 해.
알렉사 플루어 염색 여기에 제시와 뎅그열 바이러스의 직접 라벨링은 추가 라벨 단계함으로써 간접적인 항바이러스 항체 이외의 구체적인 얼룩의 가능성을 제거, 바이러스를 시각화하기 위해 필요하지 않습니다. 또한 라이브 셀 이미징에 포스트 국제화 이벤트의 실시간 추적을 허용합니다. 이 방법은 비교적 간단하며, 활용이 안정하기 때문에, 그것은 생산과 같은 긴 사슬 carbocyanine1 ,1 - dioctadecyl - 3, 3 등 lipophillic 형광 염료, 반대로 여러 실험 배치 라벨이 바이러스를 저장하는 데 사용할 수 있습니다 이상의 3 일간 추위에 저장되지 않습니다 3,3 - tetramethylindodicarbocyanine (나요) 또는 styryl 염료.
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Disclosures
우리는 공개 없어요.
Acknowledgments
이 작품은 국립 의학 연구위원회, 싱가포르에 의해 재정 지원되었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | S6297 | |
| Hydroxylamine | Sigma-Aldrich | 159417 | |
| Sodium hydroxide | Merck & Co., Inc. | 106498 | |
| AF594 succinimidyl esters | Molecular Probes, Life Technologies | A20004 | |
| PD-10 column | GE Healthcare | 17-0851-01 | |
| Hepes | Sigma-Aldrich | H6147 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S3014 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E9884 | |
| M-199 | Invitrogen | 11150 | |
| FBS | Hyclone | SH30070.03 | |
| 4-well plate | Nalge Nunc international | 176740 | |
| Coverslips | Einst | 0111520 | |
| Microscope slide | Sail Brand | 7105 | |
| 3H5 hybridoma | ATCC | HB46 | |
| 10x PBS | BUF-2040-10X1L | 1st Base | |
| Saponin | Sigma-Aldrich | S4521 | |
| BSA | Sigma-Aldrich | A7906 | |
| Magnesium chloride | Sigma-Aldrich | M2670 | |
| Calcium chloride | Sigma-Aldrich | C3306 | |
| Paraformaldehye | Sigma-Aldrich | 15,812-7 | |
| Mowiol 4-88 | Calbiochem | 475904 | |
| Dabco | Sigma-Aldrich | D27802 | |
| Tabletop centrifuge | Eppendorf | 5424 | |
| Confocal microscope | Carl Zeiss, Inc. | LSM 710 | |
| To prepare M-199 growth medium, add 50ml of FBS, 5ml of sodium pyruvate and 5ml of non-essential amino acids to 500ml of M-199, sterile filter. | |||
| To prepare M-199 maintenance medium, add 15ml of FBS, 5ml of sodium pyruvate and 5ml of non-essential amino acids to 500ml of M-199, sterile filter. | |||
References
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