Summary
Воспользовавшись достижениями в флуорофора развития и технологий визуализации, простой метод Alexa Fluor маркировки вируса денге была разработана для визуализации ранних взаимодействий между вирусом и клетки.
Abstract
Ранние события во взаимодействии вируса и клетки может иметь существенное влияние на исход инфекции. Определение факторов, влияющих на это взаимодействие может привести к более глубокому пониманию патогенеза заболевания и таким образом влиять на терапевтическую вакцину или дизайна. Таким образом, разработка методов для исследования этого взаимодействия было бы полезно. Последние достижения в области развития флуорофоров 1-3 и технологий визуализации 4 может быть использована для улучшения наших знаний о патогенезе лихорадки денге и тем самым проложить путь к снижению миллионов случаев инфекции денге, происходящих ежегодно.
Окутанный вирус денге внешние строительные леса, состоящие из 90 гликопротеина оболочки (E) димеров защиты нуклеокапсида оболочку, которая содержит единственный положительный цепь РНК геном 5. Идентичных субъединиц белка на поверхности вируса, таким образом, быть помечены амин реактивных красителей и визуализируются через иммунофлуоресцентного микроскопии. Здесь мы приводим простой способ маркировки вируса денге с Alexa Fluor сукцинимидил эфир красителя растворенные непосредственно в буфере бикарбонат натрия, который дал высокую жизнеспособных вирусов после маркировки. Существует нет стандартной процедуры для маркировки живого вируса и протокол существующих производителя по маркировке белка обычно требует восстановления красителя в диметилсульфоксид. Наличие диметилсульфоксида, даже в ничтожно малых количествах, могут блокировать продуктивной инфекции вируса, а также побудить ячейки цитотоксичность 6. Исключение использование диметилсульфоксида в этом протоколе сводится такую возможность. Alexa Fluor красители имеют более высокий фотостабильности и менее рН-чувствительной, чем общие красители, такие как флуоресцеина и родамина 2, что делает их идеальными для изучения клеточного поглощения и эндосом перевозки вируса. Сопряжение Alexa Fluor красителя не повлияло признание меченого вируса денге на вирус-специфических антител и его предполагаемым рецепторов в клетках хозяина 7. Этот метод может иметь полезные приложения в вирусологических исследований.
Protocol
1. Alexa Fluor маркировки вируса денге
- Перед маркировки реакцию, очищают вируса денге с сахарозой подушки и подготовить необходимые реактивы и оборудование, как указано в протоколе.
- Подготовка свежего 0,2 М буфере бикарбоната натрия, рН 8,5 (маркировка буфера), и 1,5 гидроксиламин буфере, рН 8,3 (Стоп-реагент), как раз перед маркировки и фильтр стерилизуют при 0,2 мкм фильтры шприц.
- Развести около 3x10 8 бляшкообразующих единиц (БОЕ) очищенного вируса денге в 1 мл маркировки буфера в 2 мл трубки. Это могут быть увеличены пропорционально для пакетной маркировки вирус.
- Разведите лиофилизированный Alexa Fluor 594 (AF594) сукцинимидил эфиров до 1 мм в маркировке буфера непосредственно перед маркировки реакции. Другие флуорохромов с Alexa Fluor красителя серии могут быть использованы в соответствии со своими потребностями. Минимизировать воздействие света от этого шага и далее.
- Добавить 100 мкл 1 мМ AF594 краски разбавляют вируса при перемешивании осторожно кончиком пипетки.
- Выдержите смесь маркировки реакции при комнатной температуре на 1 час в темноте. Смешать, осторожно инверсии каждый 15 минут.
- Спиновые трубки кратко в настольные центрифуги и добавьте 100 мкл стоп-реагента к реакционной смеси при перемешивании осторожно кончиком пипетки.
- Инкубируйте при комнатной температуре в течение дополнительный час в темноте. Смешать, осторожно инверсии каждый 15 минут.
2. Очищающий Alexa Fluor помечены вируса денге
- В то же время равновесие очистки колонки с буфером выбора. В этом эксперименте, ПД-10 колонка находится в равновесии с 25 мл HNE буфер (5 мМ HEPES, 150 мМ NaCl, 0,1 мм ЭДТА), рН 7,4, перед использованием.
- Применение меченых вируса верхней части колонны и начать собирать проточные раз помечены вирус попадает в матрицу. Заполните колонку с HNE буфера, когда все помечены вирус вошел матрицы. Откажитесь от первых 2,5 мл проточных и собирать следующий 2мл меченого вируса фракции.
- Алиготе и хранения очищенной AF594 помечены вируса денге в -80 ° С, вдали от источника света.
- Оттепель один аликвоту и определить титр вируса помечены бляшкой анализ, прежде чем использовать партию меченого вируса.
- Семенной 5x10 4 на лунку Vero клетках, выращенных в М-199 питательную среду, в 4-луночный планшет с покровным на дне и день до заражения.
- Удалить супернатант культуры в хорошо и заражают клетки с множественностью заражения от 1 меченого вируса в 100 мкл объема (разводится в М-199 содержание среду при необходимости) в течение 10 минут при температуре 37 ° C.
- Удалить inoculums и мыть дважды в покровных 1xPBS.
- Fix клеток в 3% paraformalydehyde для 30 минут.
- Вымойте покровные 3 раза в 1xPBS.
- Permeabilize клеток с пермеабилизации раствора, содержащего 0,1% сапонина и 5% БСА в 1xPBS за 30 минут.
- Инкубируйте клетки с неразбавленным центрифугирования-уточнил супернатанта 3H5 моноклональных антител культуры гибридомы за 1 час во влажной камере, защищенном от света месте.
- Вымойте покровные 3 раза промывочным буфером (1xPBS содержащей 1 мМ хлорида кальция, 1 мМ хлорид магния и 0,1% сапонина).
- Инкубируйте клетки с AF488 анти-мышиного антитела IgG, 1:100 разводят в пермеабилизации решение, за 45 минут во влажной камере, защищенном от света месте.
- Вымойте покровные 3 раза промывочным буфером и промыть один раз в деионизованной воде.
- Приложите край покровного против бумажное полотенце для слива лишней воды и смонтировать на стекло с 8μl Mowiol 4-88, содержащего 2,5% DABCO.
- Разрешить решение для монтажа для установки на ночь при 4 ° С до просмотра с помощью конфокальной микроскопии Zeiss. Последовательная приобретения должны быть выполнены волнующим флуорофора в то время, и переключение между детекторами одновременно.
- Изображения затем анализируется для сотрудничества локализации антител E белка окрашивания меченых вирусов с помощью МНК Zeiss Zen программное обеспечение, чтобы оценить степень маркировки.
3. Представитель Результаты
Примером выхода вируса денге помечены AF594 красителем показано на рисунке 2. Как правило, меньше, чем 10-кратное падение с начальным титром должны быть соблюдены следующие успешной маркировки. Однако следует отметить, что все буферы должны быть готовы свежими маркировки, чтобы быть успешным и Alexa Fluor сукцинимидил эфиры должны использоваться сразу же после восстановления, поскольку они гидролизуются в нереактивном свободных кислот в водных растворах 8.
Далее, помечены вирус должен быть проверен на достаточном флуоресценции перед использованием в экспериментах. Простой анализ иммунофлюоресценции было сделано на клетках Веро и степень маркировки может быть оценена по совместной локализации меченого вируса с анти-E меченых антител белка. Разрыватьдр. клетки были рассмотрены и типичные конфокальной изображение показано на рисунке 3. Сотрудничество локализации анализ изображений с помощью МНК Zen ПО продемонстрировали совпадение коэффициентов в пределах от 0,65 до 0,8, предполагая, что примерно от 65 до 80% вирионы были помечены краской.
Рис 1.Overall схема изображением Alexa Fluor красителем маркировку процедуры вируса денге. Во-первых, соответствующие буферы и очищенный вируса денге готовы. Alexa Fluor красителя восстанавливается и добавляется вируса денге разводят в маркировке буфера. Реакция остановился через 1 час с добавлением стоп-реагента. Впоследствии помечены вирус очищается через колонку исключения размера для удаления свободного красителя. Наконец, меченый вирус снова титруют доска анализ и проверены на флуоресценцию.
Рисунок 2. Среднее количество жизнеспособных вирионов (БОЕ / мл), как определено на мемориальной доске анализа до и после AF594 маркировки. Аликвоту AF594 помечены вируса денге талых и вновь титруют доска анализа и он обычно показывает меньше, чем 10-кратное падение с начиная титр. Ошибка полоски показывают стандартное отклонение дубликатов.
Рисунок 3. Сотрудничество локализации AF594 этикетки с вирусом денге E белков в клетках Веро. Клетки, выращенные на покровных день до были инфицированы AF594 помечены денге в МВД 1 в течение 10 минут при температуре 37 ° C. Клетки последующей фиксации и маркированы с анти-E антитела, и исследуют на колокализации E белка (зеленый) и AF594 маркировку (красный). Флуоресцентные сигналы были визуализированы под 63x увеличением использования Zeiss LSM 710 конфокальной микроскопии. Шкала бар 10 мкм. Желтый указывает области колокализации, как показано на вставке.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Хотя AF594 красителем была использована в данном докладе, широкий спектр флуорофоров в Alexa Fluor серии сукцинимидил эфиры можно получить с аналогичными химии маркировки. Это могло бы расширить применение маркировки за пределы изображения. Проточная цитометрия может быть использован как альтернатива конфокальной микроскопии для оценки степени маркировки флуорофоров, которые могут быть возбуждены и обнаружить машину СУИМ.
Alexa Fluor красители малых молекул, которые реагируют со свободными аминогруппами, прежде всего, аргинин и лизин 9, как правило, наружные остатки белков. В нашей лаборатории, сопряжение вируса денге с 100 мкм от Alexa Fluor 594 красителя при условии, достаточную яркость для получения изображений с минимальными потерями в вирусных титров. Различные яркости может быть достигнуто путем изменения концентрации красителя. Однако увеличение концентрации красителя может снизить жизнеспособность вируса 7,10. Одним из возможных ограничение вмешательства в связывание с рецепторами в связи с блокадой доступа флуорофоров. Поэтому в зависимости от приложения, оптимальный уровень маркировка должна быть определена для обеспечения баланса между степенью маркировки и функциональных abrogation10. Обратите внимание, что концентрация может также зависеть от пост-упаковке реактивность Alexa Fluor эфиры сукцинимидил 8.
Прямой маркировки вируса денге с Alexa Fluor красителя, представленные здесь, не требует каких-либо дополнительных шагов маркировки для визуализации вируса, тем самым исключая возможность неспецифического окрашивания от косвенных противовирусных антител. Он также позволяет в режиме реального времени отслеживать пост-интернализации событий в прямом эфире изображений клеток. Этот метод является относительно простым, и потому, что сопряжение стабильна, она может быть использована для производства и хранения партий меченных вирус для нескольких экспериментов, в отличие от lipophillic флуоресцентными красителями, например, с длинной цепью carbocyanine1 ,1-dioctadecyl-3, 3, 3,3-tetramethylindodicarbocyanine (DID) или стириловых красителей, которые не могут быть сохранены в холодной в течение более 3 дней.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Нам нечего раскрывать.
Acknowledgments
Эта работа финансируется Национальным Советом по медицинским исследованиям, Сингапур.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | S6297 | |
| Hydroxylamine | Sigma-Aldrich | 159417 | |
| Sodium hydroxide | Merck & Co., Inc. | 106498 | |
| AF594 succinimidyl esters | Molecular Probes, Life Technologies | A20004 | |
| PD-10 column | GE Healthcare | 17-0851-01 | |
| Hepes | Sigma-Aldrich | H6147 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S3014 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E9884 | |
| M-199 | Invitrogen | 11150 | |
| FBS | Hyclone | SH30070.03 | |
| 4-well plate | Nalge Nunc international | 176740 | |
| Coverslips | Einst | 0111520 | |
| Microscope slide | Sail Brand | 7105 | |
| 3H5 hybridoma | ATCC | HB46 | |
| 10x PBS | BUF-2040-10X1L | 1st Base | |
| Saponin | Sigma-Aldrich | S4521 | |
| BSA | Sigma-Aldrich | A7906 | |
| Magnesium chloride | Sigma-Aldrich | M2670 | |
| Calcium chloride | Sigma-Aldrich | C3306 | |
| Paraformaldehye | Sigma-Aldrich | 15,812-7 | |
| Mowiol 4-88 | Calbiochem | 475904 | |
| Dabco | Sigma-Aldrich | D27802 | |
| Tabletop centrifuge | Eppendorf | 5424 | |
| Confocal microscope | Carl Zeiss, Inc. | LSM 710 | |
| To prepare M-199 growth medium, add 50ml of FBS, 5ml of sodium pyruvate and 5ml of non-essential amino acids to 500ml of M-199, sterile filter. | |||
| To prepare M-199 maintenance medium, add 15ml of FBS, 5ml of sodium pyruvate and 5ml of non-essential amino acids to 500ml of M-199, sterile filter. | |||
References
- Olenych, S. G., Claxton, N. S., Ottenberg, G. K. &, Davidson, M. W.
- Panchuk-Voloshina, N. Alexa dyes, a series of new fluorescent dyes that yield exceptionally bright, photostable conjugates. J Histochem Cytochem. 47, 1179-1188 (1999).
- Shaner, N. C., Patterson, G. H., Davidson, M. W.
- Lippincott-Schwartz, J., Patterson, G. H. Development and use of fluorescent protein markers in living cells. Science. 300, 87-91 (2003).
- Kuhn, R. J. Structure of dengue virus: implications for flavivirus organization, maturation, and fusion. Cell. 108, 717-725 (2002).
- Aguilar, J. S., Roy, D., Ghazal, P., Wagner, E. K. Dimethyl sulfoxide blocks herpes simplex virus-1 productive infection in vitro acting at different stages with positive cooperativity. Application of micro-array analysis. BMC Infect Dis. 2, 9-9 (2002).
- Zhang, S. L., Tan, H. C., Hanson, B. J., Ooi, E. E. A simple method for Alexa Fluor dye labelling of dengue virus. J Virol Methods. 167, 172-177 (2010).
- Alexa Fluor Succinimidyl Esters (Molecular Probes. , Invitrogen. (2009).
- Huang, S. Analysis of proteins stained by Alexa dyes. Electrophoresis. 25, 779-784 (2004).
- Freistadt, M. S., Eberle, K. E. Fluorescent poliovirus for flow cytometric cell surface binding studies. J Virol Methods. 134, 1-7 (2006).
