Summary
Profiterend van de vooruitgang in de ontwikkeling fluorofoor en imaging technologie, een eenvoudige methode van Alexa Fluor etikettering van dengue virus was ontwikkeld om het begin van de interacties tussen virus en cel visualiseren.
Abstract
De vroege gebeurtenissen in de interactie tussen virus en cel kan hebben grote invloed op de uitkomst van de infectie. Het bepalen van de factoren die deze interactie van invloed zou kunnen leiden tot een beter begrip van de ziekte pathogenese en dus invloed vaccins of therapeutische design. Daarom zou de ontwikkeling van methoden om deze interactie probe nuttig zijn. Recente ontwikkelingen in fluoroforen ontwikkeling 1-3 en imaging technologie 4 kan worden benut om onze huidige kennis over dengue pathogenese te verbeteren en zo de weg vrijmaken voor de miljoenen van dengue besmettingen per jaar te verminderen.
De omhulde dengue-virus heeft een externe steiger bestaat uit 90 enveloppe glycoproteïne (E)-dimeren de bescherming van de nucleocapside shell, die een enkele positieve streng RNA genoom 5 bevat. De identieke eiwitsubeenheden op het virus oppervlak kan dus worden voorzien van een amine reactieve kleurstof en gevisualiseerd door middel van immunofluorescentie microscopie. Hier presenteren we een eenvoudige methode voor de etikettering van dengue virus met Alexa Fluor succinimidylester kleurstof direct opgelost in een natriumbicarbonaat buffer die zeer levensvatbaar virus leverde na labeling. Er is geen gestandaardiseerde procedure voor de etikettering van levend virus en bestaande fabrikant protocol voor het eiwit labeling meestal de reconstructie van kleurstof in dimethylsulfoxide vereist. De aanwezigheid van dimethylsulfoxide, zelfs in kleine hoeveelheden, kan blokkeren productieve infectie van het virus en ook leiden tot cel cytotoxiciteit 6. De uitsluiting van het gebruik van dimethylsulfoxide in dit protocol zo beperkt deze mogelijkheid. Alexa Fluor kleurstoffen hebben superieure fotostabiliteit en zijn minder pH-gevoelig dan de gewone kleurstoffen, zoals fluoresceïne en rhodamine 2, waardoor ze ideaal zijn voor het onderzoek naar cellulaire opname en endosomale transport van het virus. De vervoeging van Alexa Fluor kleurstof had geen invloed op de opname van gelabelde dengue-virus door virus-specifieke antilichamen en zijn vermeende receptoren in gastheercellen 7. Deze methode zou kunnen hebben nuttige toepassingen in virologische studies.
Protocol
1. Alexa Fluor etikettering van dengue virus
- Voor de etikettering reactie, zuiveren dengue virus met sucrose kussen en de voorbereiding van de benodigde reagentia en apparatuur, zoals aangegeven in het protocol.
- Bereid verse 0,2 M natriumbicarbonaat buffer, pH 8,5 (etikettering buffer), en 1.5M hydroxylamine buffer, pH 8,3 (stop reagens), vlak voor de etikettering en filter steriliseren met 0.2μm spuit filters.
- Verdunnen van ongeveer 3x10 8 plaque-vormende eenheden (pfu) van gezuiverd dengue virus in 1 ml van de etikettering buffer in een 2ml buis. Dit kan worden opgeschaald naar evenredigheid voor de etikettering van de batch virus.
- Los het gevriesdroogde Alexa Fluor 594 (AF594) succinimidyl esters tot 1 mm in de etikettering buffer direct voorafgaand aan de etikettering reactie. Andere fluorochromen van de Alexa Fluor kleurstof serie kan worden gebruikt volgens de eigen behoeften. Minimaliseer de blootstelling aan licht van deze stap verder.
- Voeg 100μl van de 1mm AF594 kleurstof om de verdunde virus al roerend zachtjes met de pipetpunt.
- Incubeer de etikettering reactiemengsel bij kamertemperatuur gedurende 1 uur in het donker. Meng door zachtjes te inversies elke 15 minuten.
- Spin de buis kort in een tabletop centrifuge en voeg 100μl van stopreagens om de reactie mix al roerend zachtjes met de pipetpunt.
- Incubeer bij kamertemperatuur gedurende een extra uur in het donker. Meng door zachtjes te inversies elke 15 minuten.
2. Zuiverende Alexa Fluor gelabeld dengue virus
- In de tussentijd, evenwicht de zuivering kolom met buffer van de keuze. In dit experiment, een PD-10 kolom geëquilibreerd met 25ml van HNE buffer (5mm Hepes, 150mm NaCl, 0,1 mm EDTA), pH 7,4, voor gebruik.
- Van toepassing zijn de gelabelde virus naar de top van de kolom en beginnen met het verzamelen van de doorstroming als de gelabelde virus komt in de matrix. Vul de kolom met HNE buffer een keer al het label virus is binnengekomen de matrix. Gooi de eerste 2,5 ml van de doorstroom en het verzamelen van de volgende 2 ml van gelabeld virus fractie.
- Aliquot en op te slaan gezuiverd AF594 gelabeld dengue-virus bij -80 ° C, weg van de lichtbron.
- Dooi een aliquot en bepaal de titer van de gelabelde virus door plaque assay voor het gebruik van de batch van gelabelde virus.
- Zaad 5x10 4 per putje van Vero-cellen, gekweekt in M-199 groeimedium, in een 4-wells plaat met een dekglaasje op de bodem van goed een dag voor de infectie.
- Verwijder de kweeksupernatant in goed en de cellen met een multipliciteit van infectie van een van de gelabelde virus in 100μl volume (verdund in M-199 onderhoud medium zoals vereist) infecteren voor 10min bij 37 ° C.
- Verwijder de inoculums en twee keer was de dekglaasjes in 1xPBS.
- Fixeer de cellen in 3% paraformalydehyde voor 30 minuten.
- Was de dekglaasjes 3 keer in 1xPBS.
- Permeabilize de cellen met permeabilisatie oplossing, die 0,1% saponine en 5% BSA in 1xPBS voor 30 minuten.
- Incubeer de cellen met onverdunde centrifugatie-verduidelijkt supernatant van 3H5 monoklonaal antilichaam hybridoma cultuur voor 1 uur in een vochtige kamer, beschermd tegen licht.
- Was de dekglaasjes 3 keer in wasbuffer (1xPBS met 1 mM calciumchloride, 1 mM magnesiumchloride en 0,1% saponine).
- Incubeer de cellen met AF488 anti-muis IgG antilichaam, 1:100 verdund in permeabilisatie oplossing, voor 45 min in de vochtige kamer, beschermd tegen licht.
- Was de dekglaasjes 3 keer in wasbuffer en spoel een keer in gedemineraliseerd water.
- Dep de rand van dekglaasje tegen een papieren handdoek om overtollig water af te voeren en monteren op glasplaatje met 8μl Mowiol 4-88 met 2,5% Dabco.
- Laat de montage oplossing een nacht ingesteld op 4 ° C voordat u deze bekijkt met behulp van een Zeiss confocale microscoop. Sequentiële overnames moet worden uitgevoerd spannend een fluorofoor in een tijd en schakelen tussen de detectoren gelijktijdig.
- Beelden worden vervolgens geanalyseerd voor co-lokalisatie van de E-eiwit antilichaam kleuring met de gelabelde virus met behulp van de LSM Zeiss Zen-software om de mate van labeling te schatten.
3. Representatieve resultaten
Een voorbeeld van de opbrengst van dengue virus gemerkt met AF594 kleurstof is weergegeven in figuur 2. Normaal gesproken, zou minder dan 10-voudige daling ten opzichte van de initiële titer waargenomen worden na succesvol etikettering. Toch moet worden opgemerkt dat alle buffers moeten vers worden bereid voor de etikettering om succesvol te zijn en de Alexa Fluor succinimidyl esters moet onmiddellijk worden gebruikt na reconstitutie als ze hydrolyseren in niet-reactieve vrije zuren in waterige oplossingen 8.
Vervolgens de gelabelde virus moet worden gecontroleerd op voldoende fluorescentie voor gebruik in experimenten. Een eenvoudige immunofluorescentie test werd gedaan op Vero-cellen en de mate van de etikettering kunnen worden geschat op basis van de co-lokalisatie van de gelabelde virus met anti-E eiwit antilichaam kleuring. ScheidenAl cellen werden onderzocht en een typisch confocale afbeelding wordt weergegeven in figuur 3. Co-lokalisatie analyse van de beelden met behulp van de LSM Zen software aangetoond overlap coëfficiënten variërend 0,65 tot 0,8, wat suggereert dat ongeveer 65 tot 80% van de virionen waren gelabeld met de kleurstof.
Figuur 1.De totale regeling beeltenis van de Alexa Fluor kleurstof etikettering van dengue virus procedure. Eerste, de relevante buffers en gezuiverd dengue virus zijn voorbereid. De Alexa Fluor kleurstof is opgelost en toegevoegd aan het dengue virus verdund in de etikettering buffer. De reactie is dan een uur later gestopt met de toevoeging van stopreagens. Vervolgens wordt het label virus gezuiverd door middel van een size exclusion kolom om gratis kleurstof te verwijderen. Tot slot wordt de gelabelde virus opnieuw getitreerd door plaque assay en getest voor fluorescentie.
Figuur 2. Gemiddeld aantal levensvatbare virionen (pfu / ml) zoals bepaald op een plaque assay voor en na de AF594 etikettering. Een deel van de AF594 gelabeld dengue-virus is ontdooid en opnieuw getitreerd door plaque assay en het typisch shows minder dan 10-voudige daling ten opzichte van de start titer. Foutbalken geven de standaarddeviatie van duplicaten.
Figuur 3. Co-lokalisatie van AF594 etiketten met dengue virus E eiwitten in Vero-cellen. Cellen gekweekt op dekglaasjes de dag voorafgaand waren geïnfecteerd met AF594 gelabeld dengue op MOI van een gedurende 10 minuten bij 37 ° C. De cellen werden vervolgens vast en voorzien van anti-E antilichaam, en onderzocht colocalization van E eiwit (groen) en AF594 etikettering (rood). Fluorescerende signalen werden zichtbaar onder 63x vergroting met behulp van Zeiss LSM 710 confocale microscoop. Schaal bar is 10μm. Geel geven gebieden van colocalization, zoals te zien in de inzet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Hoewel AF594 kleurstof werd gebruikt in dit rapport, een brede waaier van fluoroforen in de Alexa Fluor succinimidyl esters serie is leverbaar met vergelijkbare etikettering chemie. Dit kan uitbreiding van de etikettering van toepassing buiten beeldvorming. Flowcytometrie kan worden gebruikt als een alternatief voor de confocale microscopie voor het schatten van de mate van etikettering voor fluoroforen die kunnen worden opgewonden en gedetecteerd door de FACS apparaat.
Alexa Fluor kleurstoffen zijn kleine moleculen die reageren met vrije aminogroepen, voornamelijk arginine en lysine 9, die normaal naar buiten gerichte resten van eiwitten. In ons laboratorium, vervoeging van dengue virus met 100 urn van Alexa Fluor 594 dye voldoende helderheid voor de beeldvorming met minimaal verlies in de virale titer. Verschillende helderheid kan worden bereikt door het variëren van de concentratie van de kleurstof gebruikt. Echter, het verhogen van de kleurstof concentratie te verminderen virus levensvatbaarheid 7,10. Een mogelijke beperking is de inmenging in receptor binding als gevolg van de blokkade van de toegang van de fluoroforen. Daarom, afhankelijk van de toepassing, moet een optimaal niveau van de etikettering worden vastgesteld om een evenwicht te vinden tussen de mate van etikettering en functionele abrogation10 te verzekeren. Let wel dat de concentratie ook kan worden beïnvloed door de post-verpakking reactiviteit van de Alexa Fluor succinimidyl esters 8.
De directe etikettering van dengue virus met Alexa Fluor dye hier gepresenteerde vereist geen aanvullende etikettering stappen om het virus te visualiseren, dus afschaffen van de mogelijkheid van niet-specifieke kleuring van indirecte antivirale antilichamen. Het staat ook voor real-time tracking van de post-internalisatie gebeurtenissen in live cell imaging. Deze methode is relatief eenvoudig, en omdat de vervoeging is stabiel, het kan worden gebruikt om te produceren en op te slaan batch-gelabeld virus voor meerdere experimenten in tegenstelling tot lipofilisch fluorescente kleurstoffen, zoals de lange-keten carbocyanine1 ,1-dioctadecyl-3, 3, 3,3-tetramethylindodicarbocyanine (DID) of styrylkleurstoffen kleurstoffen, die niet in de kou worden opgeslagen voor meer dan 3 dagen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
We hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Dit werk werd gefinancierd door de National Medical Research Council, Singapore.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | S6297 | |
| Hydroxylamine | Sigma-Aldrich | 159417 | |
| Sodium hydroxide | Merck & Co., Inc. | 106498 | |
| AF594 succinimidyl esters | Molecular Probes, Life Technologies | A20004 | |
| PD-10 column | GE Healthcare | 17-0851-01 | |
| Hepes | Sigma-Aldrich | H6147 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S3014 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E9884 | |
| M-199 | Invitrogen | 11150 | |
| FBS | Hyclone | SH30070.03 | |
| 4-well plate | Nalge Nunc international | 176740 | |
| Coverslips | Einst | 0111520 | |
| Microscope slide | Sail Brand | 7105 | |
| 3H5 hybridoma | ATCC | HB46 | |
| 10x PBS | BUF-2040-10X1L | 1st Base | |
| Saponin | Sigma-Aldrich | S4521 | |
| BSA | Sigma-Aldrich | A7906 | |
| Magnesium chloride | Sigma-Aldrich | M2670 | |
| Calcium chloride | Sigma-Aldrich | C3306 | |
| Paraformaldehye | Sigma-Aldrich | 15,812-7 | |
| Mowiol 4-88 | Calbiochem | 475904 | |
| Dabco | Sigma-Aldrich | D27802 | |
| Tabletop centrifuge | Eppendorf | 5424 | |
| Confocal microscope | Carl Zeiss, Inc. | LSM 710 | |
| To prepare M-199 growth medium, add 50ml of FBS, 5ml of sodium pyruvate and 5ml of non-essential amino acids to 500ml of M-199, sterile filter. | |||
| To prepare M-199 maintenance medium, add 15ml of FBS, 5ml of sodium pyruvate and 5ml of non-essential amino acids to 500ml of M-199, sterile filter. | |||
References
- Olenych, S. G., Claxton, N. S., Ottenberg, G. K. &, Davidson, M. W.
- Panchuk-Voloshina, N. Alexa dyes, a series of new fluorescent dyes that yield exceptionally bright, photostable conjugates. J Histochem Cytochem. 47, 1179-1188 (1999).
- Shaner, N. C., Patterson, G. H., Davidson, M. W.
- Lippincott-Schwartz, J., Patterson, G. H. Development and use of fluorescent protein markers in living cells. Science. 300, 87-91 (2003).
- Kuhn, R. J. Structure of dengue virus: implications for flavivirus organization, maturation, and fusion. Cell. 108, 717-725 (2002).
- Aguilar, J. S., Roy, D., Ghazal, P., Wagner, E. K. Dimethyl sulfoxide blocks herpes simplex virus-1 productive infection in vitro acting at different stages with positive cooperativity. Application of micro-array analysis. BMC Infect Dis. 2, 9-9 (2002).
- Zhang, S. L., Tan, H. C., Hanson, B. J., Ooi, E. E. A simple method for Alexa Fluor dye labelling of dengue virus. J Virol Methods. 167, 172-177 (2010).
- Alexa Fluor Succinimidyl Esters (Molecular Probes. , Invitrogen. (2009).
- Huang, S. Analysis of proteins stained by Alexa dyes. Electrophoresis. 25, 779-784 (2004).
- Freistadt, M. S., Eberle, K. E. Fluorescent poliovirus for flow cytometric cell surface binding studies. J Virol Methods. 134, 1-7 (2006).
