Summary
Approfittando dei progressi nello sviluppo fluoroforo e tecnologia di imaging, un metodo semplice di Alexa Fluor etichettatura dei virus dengue è stato ideato per visualizzare le prime interazioni tra virus e cellule.
Abstract
Gli eventi presto l'interazione tra virus e cellule possono avere un'influenza profonda sul risultato di infezione. Determinare i fattori che influenzano questa interazione potrebbe portare a una migliore comprensione della patogenesi della malattia e quindi influenzare vaccino terapeutico o di progettazione. Quindi, lo sviluppo di metodi per sondare questa interazione potrebbe essere utile. Più recenti progressi della fluorofori sviluppo 1-3 e tecnologia di imaging 4 può essere sfruttato per migliorare le nostre attuali conoscenze sulla patogenesi dengue e quindi aprire la strada per ridurre i milioni di dengue che si verificano ogni anno.
Il virus dengue ha un involucro esterno costituito da un'impalcatura di 90 busta glicoproteina (E) dimeri che proteggono il serbatoio nucleocapside, che contiene un singolo filamento positivo di RNA del genoma 5. Le subunità proteiche identiche sulla superficie del virus può quindi essere etichettato con un colorante reattivo ammina e visualizzati tramite microscopia a immunofluorescenza. Qui, presentiamo un semplice metodo di etichettatura dei virus della dengue con Alexa Fluor succinimidile estere colorante sciolto direttamente in un buffer di bicarbonato di sodio che ha dato virus altamente vitali dopo etichettatura. Non esiste una procedura standardizzata per l'etichettatura dei virus vivo e protocollo del produttore esistente per l'etichettatura delle proteine di solito richiede la ricostituzione di colorante in dimetilsolfossido. La presenza di dimetilsolfossido, anche in piccole quantità, in grado di bloccare l'infezione produttiva da virus e anche indurre citotossicità delle cellule 6. L'esclusione dell'uso di dimetilsolfossido in questo protocollo così ridotto questa possibilità. Alexa Fluor coloranti hanno fotostabilità superiore ed è meno sensibile al pH rispetto ai coloranti comuni, come la fluoresceina e rodamina 2, che li rende ideali per gli studi sulla captazione cellulare e il trasporto endosomali del virus. La coniugazione di Alexa Fluor colorante non ha influenzato il riconoscimento dei virus della dengue etichettati da virus-specifici anticorpi ed i suoi recettori putativi in cellule ospiti 7. Questo metodo potrebbe avere applicazioni utili in studi virologici.
Protocol
1. Alexa Fluor etichettatura dei virus dengue
- Prima che la reazione di marcatura, purificare virus della dengue con cuscino di saccarosio e preparare i reagenti necessari e le attrezzature, come indicato nel protocollo.
- Preparare fresca 0,2 M tampone bicarbonato di sodio, pH 8,5 (tampone etichettatura), e 1,5 M tampone idrossilammina, pH 8.3 (fermata reagente), poco prima di etichettatura e filtro sterilizzare con filtri per siringa 0.2μm.
- Diluire a circa 3x10 8 unità placca formando (PFU) di depurata virus della dengue in 1 ml di etichettatura tampone in una provetta 2 ml. Questo può essere scalata proporzionalmente per l'etichettatura lotto di virus.
- Ricostituire il liofilizzato Alexa Fluor 594 (AF594) esteri succinimidile a 1 mm di etichettatura tampone immediatamente prima della reazione di marcatura. Fluorocromi altro dal Alexa Fluor colorante serie può essere utilizzato in base alle proprie esigenze. Ridurre al minimo l'esposizione alla luce a partire da questo passo.
- Aggiungere 100μl del colorante AF594 1mm a virus diluito mescolando delicatamente con la punta della pipetta.
- Incubare la miscela di reazione etichettatura a temperatura ambiente per 1 ora al buio. Miscelare inversioni dolce ogni 15 minuti.
- Spin brevemente il tubo in una centrifuga da tavolo e aggiungere 100μl di reagente stop alla miscela di reazione mescolando delicatamente con la punta della pipetta.
- Incubare a temperatura ambiente per un'altra ora al buio. Miscelare inversioni dolce ogni 15 minuti.
2. Purificante Alexa Fluor etichettati virus della dengue
- Nel frattempo, equilibrare la colonna di purificazione con tampone di scelta. In questo esperimento, un PD-10 colonna è equilibrata con 25 ml di tampone HNE (Hepes 5 mm, 150 mm di NaCl, 0,1 mm EDTA), pH 7,4, prima dell'uso.
- Applicare il virus etichettati per la parte superiore della colonna e iniziare a raccogliere le flow-through, una volta che il virus entra nella matrice etichettato. Riempire la colonna con tampone HNE una volta che tutti i virus etichettato è entrato nella matrice. Scartare il primo di 2,5 ml flow-through e raccogliere i prossimi 2 ml di virus frazione etichettati.
- Aliquota e memorizzare purificata AF594 virus della dengue etichettati a -80 ° C, lontano da fonti di luce.
- Scongelare uno aliquota e determinare il titolo del virus etichettato con il saggio della placca prima di utilizzare il lotto di virus etichettati.
- Semi di 5x10 4 per bene di cellule Vero, coltivate in M-199 terreno di coltura, in un 4-pozzetti con un coprioggetto sul fondo di ben un giorno prima dell'infezione.
- Rimuovere il surnatante cultura in bene e infettare le cellule con molteplicità di infezione di 1 del virus etichettati in volume 100μl (diluito in M-199 terreno di mantenimento, come richiesto) per 10 minuti a 37 ° C.
- Rimuovere il inoculums e lavare i coprioggetti due volte in 1xPBS.
- Fissare le cellule nel 3% paraformalydehyde per 30 minuti.
- Lavare i coprioggetti 3 volte in 1xPBS.
- Permeabilize le cellule con una soluzione di permeabilizzazione contenente saponina 0,1% e il 5% BSA in 1xPBS per 30 minuti.
- Incubare le cellule con diluito centrifugazione-sopranatante chiarificato di 3H5 cultura anticorpi monoclonali ibridomi per 1 ora in camera umida, al riparo dalla luce.
- Lavare i coprioggetti 3 volte in tampone di lavaggio (1xPBS contenente cloruro di calcio 1mm, cloruro di magnesio 1 mM e 0,1 saponina%).
- Incubare le cellule con AF488 anti-topo IgG, 1:100 diluito in soluzione permeabilizzazione, per 45 minuti in camera umida, al riparo dalla luce.
- Lavare i coprioggetti 3 volte in tampone di lavaggio e risciacquo, una volta in acqua deionizzata.
- Tamponare il bordo del coprioggetti contro un tovagliolo di carta per drenare l'acqua in eccesso e montare su vetrino con 8μl Mowiol 4-88 DABCO contenente 2,5%.
- Lasciare che la soluzione di montaggio per impostare notte a 4 ° C prima di visualizzare utilizzando un microscopio confocale Zeiss. Acquisizioni sequenziale deve essere eseguito eccitante fluoroforo alla volta e il passaggio tra i rivelatori in concomitanza.
- Le immagini sono poi analizzate per la co-localizzazione delle proteine e degli anticorpi colorazione con il virus etichettato con il software LSM Zen Zeiss per stimare il grado di etichettatura.
3. Rappresentante Risultati
Un esempio del rendimento del virus dengue marcato con colorante AF594 è illustrato nella figura 2. Normalmente, a meno di 10 volte cadere dal titolo iniziale dovrebbe essere osservate le seguenti etichette di successo. Tuttavia, va notato che tutti i tamponi devono essere preparati freschi per l'etichettatura per avere successo e Alexa Fluor esteri succinimidile deve essere utilizzato immediatamente dopo la ricostituzione come idrolizzano in acidi liberi reattivi in soluzioni acquose 8.
Successivamente, il virus etichettato deve essere controllato per fluorescenza sufficiente prima dell'uso negli esperimenti. Un semplice test di immunofluorescenza è stato fatto su cellule Vero e il grado di etichettatura può essere definita sulla base dei co-localizzazione del virus etichettati con anti-E colorazione delle proteine anticorpali. SeverAl cellule sono state esaminate e una tipica immagine confocale è mostrata in Figura 3. Co-localizzazione di analisi delle immagini utilizzando il software LSM Zen dimostrato sovrapposizione coefficienti che variano dal 0,65-0,8, il che suggerisce che circa il 65 l'80% dei virioni sono stati etichettati con il colorante.
Figura schema 1.Overall raffigurante la Alexa Fluor etichettatura tintura di procedura virus della dengue. In primo luogo, i buffer pertinenti e virus dengue purificato sono preparati. Il Alexa Fluor colorante è ricostituito e ha aggiunto al virus dengue diluito in tampone di etichettatura. La reazione è allora fermato dopo 1 ora con l'aggiunta di reagente di arresto. Successivamente, il virus marcato è purificata attraverso una colonna di esclusione dimensioni per rimuovere colorante libero. Infine, il virus etichettato è ri-titolato mediante test placca e testati per fluorescenza.
Figura 2. Il numero medio di virioni vitali (pfu / ml) su un determinato dosaggio placca prima e dopo l'AF594 etichettatura. Un'aliquota del virus AF594 etichettato dengue è scongelato e ri-titolato con il saggio della placca e si vede in genere meno di 10 volte caduta da il titolo di partenza. Le barre di errore indicano la deviazione standard di duplicati.
Figura 3. Co-localizzazione di AF594 etichette con le proteine del virus dengue E su cellule Vero. Cellule coltivate su vetrini del giorno precedente sono stati infettati con AF594 dengue etichettate MOI di 1 per 10 minuti a 37 ° C. Le cellule sono state successivamente fissa e marcato con anticorpi anti-E, ed esaminati per colocalizzazione della proteina E (verde) e AF594 etichettatura (rosso). Segnali fluorescenti sono state visualizzate sotto ingrandimento 63x con Zeiss LSM 710 microscopio confocale. Barra di scala è 10μm. Giallo indicare le aree di colocalizzazione, come mostrato nel riquadro.
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Discussion
Anche se AF594 colorante è stato utilizzato in questo rapporto, una vasta gamma di fluorofori nella serie Alexa Fluor succinimidile esteri è disponibile con la chimica etichettatura simili. Questo potrebbe estendere l'applicazione dell'etichettatura di là di imaging. Citometria a flusso può essere usato come alternativa alla microscopia confocale per valutare il grado di etichettatura per fluorofori che può essere eccitato e individuate dalla macchina FACS.
Alexa Fluor coloranti sono piccole molecole che reagiscono con gruppi amminici liberi, in primo luogo l'arginina e lisina 9, normalmente rivolto verso l'esterno i residui di proteine. Nel nostro laboratorio, coniugazione dei virus della dengue con 100μM di Alexa Fluor 594 colorante fornito luminosità sufficiente per l'imaging con una perdita minima del titolo virale. Diversa luminosità può essere ottenuto variando la concentrazione di colorante usato. Tuttavia, aumentando la concentrazione di colorante può ridurre la vitalità del virus 7,10. Un limite possibile è l'interferenza nel legame recettore a causa del blocco di accesso da parte del fluorofori. Pertanto, in funzione dell'applicazione, un livello ottimale di etichettatura dovrebbe essere determinato ad assicurare un equilibrio tra il grado di etichettatura e abrogation10 funzionale. Do atto che la concentrazione può anche essere influenzata dal post-confezionamento reattività del Alexa Fluor esteri succinimidile 8.
L'etichettatura diretta del virus della dengue con Alexa Fluor colorante qui presentati non richiede alcuna procedura di etichettatura supplementare per visualizzare il virus, eliminando così la possibilità di colorazione aspecifica da indiretto anticorpi antivirali. Inoltre permette in tempo reale il monitoraggio della post-internalizzazione eventi nel campo dell'imaging cellule vive. Questo metodo è relativamente semplice, e perché la coniugazione è stabile, può essere utilizzato per produrre e immagazzinare lotto marcato virus per esperimenti più rispetto ai coloranti lipophillic fluorescenti, come ad esempio a catena lunga carbocyanine1 ,1-dioctadecyl-3, 3, coloranti 3,3-tetramethylindodicarbocyanine (DID) o styryl, che non possono essere conservati al freddo per più di 3 giorni.
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Disclosures
Non abbiamo nulla da rivelare.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato finanziato dal Medical Consiglio Nazionale delle Ricerche, Singapore.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | S6297 | |
| Hydroxylamine | Sigma-Aldrich | 159417 | |
| Sodium hydroxide | Merck & Co., Inc. | 106498 | |
| AF594 succinimidyl esters | Molecular Probes, Life Technologies | A20004 | |
| PD-10 column | GE Healthcare | 17-0851-01 | |
| Hepes | Sigma-Aldrich | H6147 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S3014 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E9884 | |
| M-199 | Invitrogen | 11150 | |
| FBS | Hyclone | SH30070.03 | |
| 4-well plate | Nalge Nunc international | 176740 | |
| Coverslips | Einst | 0111520 | |
| Microscope slide | Sail Brand | 7105 | |
| 3H5 hybridoma | ATCC | HB46 | |
| 10x PBS | BUF-2040-10X1L | 1st Base | |
| Saponin | Sigma-Aldrich | S4521 | |
| BSA | Sigma-Aldrich | A7906 | |
| Magnesium chloride | Sigma-Aldrich | M2670 | |
| Calcium chloride | Sigma-Aldrich | C3306 | |
| Paraformaldehye | Sigma-Aldrich | 15,812-7 | |
| Mowiol 4-88 | Calbiochem | 475904 | |
| Dabco | Sigma-Aldrich | D27802 | |
| Tabletop centrifuge | Eppendorf | 5424 | |
| Confocal microscope | Carl Zeiss, Inc. | LSM 710 | |
| To prepare M-199 growth medium, add 50ml of FBS, 5ml of sodium pyruvate and 5ml of non-essential amino acids to 500ml of M-199, sterile filter. | |||
| To prepare M-199 maintenance medium, add 15ml of FBS, 5ml of sodium pyruvate and 5ml of non-essential amino acids to 500ml of M-199, sterile filter. | |||
References
- Olenych, S. G., Claxton, N. S., Ottenberg, G. K. &, Davidson, M. W. The Fluorescent Protein Color Palette. Current Protocols in Cell Biology. 21.5, 1-34 (2007).
- Panchuk-Voloshina, N. Alexa dyes, a series of new fluorescent dyes that yield exceptionally bright, photostable conjugates. J Histochem Cytochem. 47, 1179-1188 (1999).
- Shaner, N. C., Patterson, G. H., Davidson, M. W. Advances in fluorescent protein technology. J Cell Sci. 120, 4247-4260 (2007).
- Lippincott-Schwartz, J., Patterson, G. H. Development and use of fluorescent protein markers in living cells. Science. 300, 87-91 (2003).
- Kuhn, R. J. Structure of dengue virus: implications for flavivirus organization, maturation, and fusion. Cell. 108, 717-725 (2002).
- Aguilar, J. S., Roy, D., Ghazal, P., Wagner, E. K. Dimethyl sulfoxide blocks herpes simplex virus-1 productive infection in vitro acting at different stages with positive cooperativity. Application of micro-array analysis. BMC Infect Dis. 2, 9-9 (2002).
- Zhang, S. L., Tan, H. C., Hanson, B. J., Ooi, E. E. A simple method for Alexa Fluor dye labelling of dengue virus. J Virol Methods. 167, 172-177 (2010).
- Alexa Fluor Succinimidyl Esters (Molecular Probes. , Invitrogen. (2009).
- Huang, S. Analysis of proteins stained by Alexa dyes. Electrophoresis. 25, 779-784 (2004).
- Freistadt, M. S., Eberle, K. E. Fluorescent poliovirus for flow cytometric cell surface binding studies. J Virol Methods. 134, 1-7 (2006).
