Summary
hypoxia inducible 인자 - 1α 활동 Bioluminescence 이미징은 유방암 뇌 전이의 마우스 모델에서 종양 intracranial hypoxia 개발을 모니터에 적용됩니다.
Abstract
이곳은 종양 hypoxia은 악성 진행을 촉진하고 부정적인 치료 반응에 영향을 미치는에 중요한 역할을 것을 인식됩니다. 때문에 이러한 뿌리 깊은 orthotopic 종양에서 모니터링하는 효율적인 수단의 부족 악성 뇌 종양의 intracranial 개발하는 동안 생체내, 종양 hypoxia의 현장에 대한 약간의 지식이있다. 루시페라제 유전자를 표현하는 살아있는 세포에 의해 방출되는 빛의 감지에 따라 Bioluminescence 이미징 (BLI)는, 빠르게 잠복기 동물 연구에서 치료에 대한 응답으로 종양의 성장이나 종양 크기 변화를 평가하기 위해, 특히 암 연구에 채택되었습니다. 또한, 발기인 순서의 제어하에 기자의 유전자를 표현하여, 특정 유전자 발현이 BLI에 의해 비 invasively 모니터링할 수 있습니다. hypoxic 스트레스에서 신호 응답은 여러 유전자의 전사를 드라이브에 주로 hypoxia inducible 인자 - 1α (HIF - 1α)를 통해 중재 수 있습니다. 따라서, 우리는 안정적으로 인간 유방암 세포 MDA - MB231 (MDA-MB231/5HRE-ODD-luc). 체외 HIF - 1α bioluminescence 분석에 의해 수행에 transfected HIF - 1α 기자 구조, 5HRE - ODD 룩을 사용한 normoxia에있는 세포 (21 % O 2) 제어 역할을하면서, BLI 전에 24 시간을위한 hypoxic 챔버 (0.1 % O 2)에 transfected 세포를 잠복기. hypoxia에서 세포에 대한 관찰 상당히 높은 광자 플럭스은 normoxia 이들에 비해 자사의 발기인으로 증가 HIF - 1α 바인딩 (HRE 요소)을 제안합니다. 셀은 유방암 뇌 전이 모델을 수립하기 위해 마우스 두뇌에 직접 주입됩니다. 종양 hypoxia 역학의 생체내 bioluminescence 이미징에서 주입 후 2 wks을 시작하고 일주일에 한 번 반복됩니다. BLI는 증가 intracranial 종양의 hypoxia을 나타내는, 종양 진행으로 두뇌에서 빛을 신호를 증가 보여줍니다. Histological과 immunohistochemical 연구는 생체내 이미징 결과를 확인하는 데 사용됩니다. 여기, 우리는 체외 HIF - 1α bioluminescence 분석, intracranial 종양의 hypoxia를 모니터링하는 생체내 bioluminescence 이미징에의 누드 마우스와 응용 프로그램에서 유방암 뇌 전이의 수술 설립의 방법을 소개합니다.
Protocol
모든 동물의 절차는 텍사스 대학의 남서부 의료 센터의 기관 동물 케어 및 사용위원회에 의해 승인되었습니다.
1. 체외 HIF - 1α bioluminescence 분석에서
- 재료 및 방법 :
- 인간 전이성 유방암 세포주 MDA - MB231은 소설 HIF - 1 - 의존 리포터 유전자로 transfected, 5HRE - ODD 룩은 박사 하라다에 의해 생성되었다.
- hypoxic 조건에서 산소에 의존 열화 도메인 (ODD) 루시페라제 융합 단백질의 향상된 표현은 hypoxia - 응답 요소 5 부 (5HRE)에 의해 구동됩니다. ODD의 존재는 normoxic 조건에서 매우 낮은 배경 루시페라제 활동 결과 ODD 룩 단백질의 저하가 발생합니다. 따라서이 소설의 시스템은 실시간 영상으로 종양의 hypoxic 영역을 감지하는 데 사용할 수 있습니다. 이 5HRE - ODD 룩 표현 벡터의 공사 하라다 외 1,2에 의해보고되었습니다.
- normoxia 또는 hypoxia에 따라 문화 세포 :
- 10% 태아 소 혈청 (FBS) DMEM의 1 % 글루타민, 400 μg / G418의 ML의 항생제, 1 % 페니실린 / 스트렙토 마이신을 포함하는 배지에서 재조합 MDA - MB231 세포를 유지합니다.
- 체외 HIF - 1α bioluminescence 분석, 플레이트 3에 대한 X 10 2 백 6 자 요리의 각 우물에 5HRE - ODD 룩 벡터를 표현 5 MDA - MB231 세포.
- normoxic 조건 (21 % O 2)에 따라 다른 접시를 유지하면서 세포가 하룻밤 배양 후 접시 벽을 첨부하고 hypoxia 연구 hypoxia 챔버 (Billups - 로텐버그 주식 델마, CA) 하나의 요리를 전송할 수 있습니다.
- 가스 실린더와 입구 포트 튜빙을 연결하여 0.1 % O 2 챔버 및 가스 챔버를 재조 립.
참고 : 입구와 출구 포트 클램프 모두가이 절차를 수행하는 동안 열려 있어야합니다. - 챔버가 플라스틱 클램프를 닫아 정화 및 인감 챔버 후 가스 소스를 분리하십시오.
- 5% CO 2와 37 ° C 배양기에서 챔버를 놓습니다.
참고 : 챔버는 문화의 과도한 증발을 방지하기 위해 humidified해야합니다. 챔버 20 ML 멸균 물 - 이것은 10 배치하여 수행할 수 있습니다.
- Bioluminescence 분석 :
- 24 시간 보육 후, 미디어를 제거하고 얼음 차가운 PBS (2X)로 빠르게 세포를 씻으십시오.
- Luciferin 100 μl (골드 생명 공학, 세인트 루이스, MO)와 차가운 PBS 1 ML을 추가합니다.
- 다양한 노출 시간 (1, 30, 60, 180 s)와 BL 영상 (IVIS 스펙트럼 시스템, 캘리퍼스 생명 과학, Hopkinton, MA) 취득.
- 각각이 잘 살아있는 이미지 소프트웨어 (캘리퍼스 생명 과학)를 사용하여 빛의 강도를 측정합니다.
2. 유방암 뇌 전이 모델의 구축
- MDA-MB231/5HRE-ODD-luc 세포의 준비
- 10% FBS, 1 %의 글루타민, 1 % 페니실린 / 스트렙토 마이신을 포함 DEME 매체 MDA-MB231/5HRE-ODD-luc 세포를 검색과 문화.
- 2~3일 모든 매체를 교체합니다. Tripsinize들이 80 % 합류에 도달하면 세포를 씻으십시오.
- 세포의 적절한 숫자를 카운트 4 μl 볼륨 10 5 세포의 최종 농도 25 %의 Matrigel (BD Biosciences, 산호세, CA)와 혈청 무료 DEME 매체에서 그들을 resuspend.
- intracranial 주사하기 전에 얼음 장소 세포.
- 외과 이식
- 여성 누드 마우스 (BALB / C 뉴 / 뉴, 국립 암 연구소, 베데스다, MD) 이전 4~6주에서이 연구에 사용됩니다.
- 마취 (유도 챔버에서 O2 / isoflurane 3%; 박스터 인터내셔널, 디어 필드, IL, 미국에서 isoflurane)와 산소 (1 DM 3 / 분) (1 %) isoflurane 수술 3 중에있는 동물을 유지합니다.
- 오른쪽 정수리 피부 betadine 후 이전 절개 70 %의 알코올로 준비되어야합니다.
- 고속 드릴을 사용 버는 코로나 봉합과 saggital 치료 측면 2mm로 두개골, 1mm 앞쪽에의 오른쪽 반구의 1mm 구멍.
- 4 μl 세포 혼합물 (10 5 셀) 10 μl 해밀턴 주사기를 (해밀턴 회사, 리노, NV) 사용하여 그립니다. 바로 바로 꼬리 diencephalon, 맞춤 제작 32G 해밀턴 바늘을 사용하여 경질의 mater 아래 1.5 mm로 세포를 주사. 탈퇴하기 전에 약 30 s에 대한 장소에서 바늘 보관하십시오. 32G 좋은 바늘의 사용은 조직 손상을 최소화합니다.
- 뼈 왁스로 버는 구멍을 입력하고 흡수성 봉합과 두피를 닫습니다.
- 70 % 알코올로 절개 지역을 준비합니다.
- buprenorphine 진통제에게 이틀 동안 매 12 시간을 적용합니다.
3. 유방암 뇌 전이에 종양 hypoxia 역학 생체내 bioluminescence 이미징에서
- 세로 bioluminescence 이미징을 개시 (IVIS 스펙트럼 시스템) 이주 8 주일에 한번 intracranial 주입 반복 후-10 주.
- 한 번에 세 생쥐 (3 % 유도 챔버에서 O 2 / isoflurane)를 마취
- 이전 4 자세히 설명한대로 각 마우스의 목 지역에서 subcutaneously, D - luciferin (골드 바이오 120, 최저 80 μl의 총 볼륨의 PBS에서 MG / kg)의 솔루션을 관리할 수 있습니다.
D - luciferin는 무독성이며 그대로 혈액 뇌 장벽 (BBB)와 세포 세포막을 관통 3,5 수있는 것으로 표시되었습니다.
- 이미지 챔버에서 3 쥐를 장소와 산소 (1 DM 3 / 분) (1 %) isoflurane 이미징 동안 같이 유지.
- luciferin 주입 후 5 분 동안은 다양한 노출 시간의 배열 (1, 30, 60, 180 s)와 BL 영상을 획득.
우리의 관측 피크 발광 시간이 목에 지역 3,4에서 luciferin의 피하 관리 후 5 분 관한 것을 보여줍니다.
- 관심 영역에 절대 광자 카운트 (광자 / 초)를 사용하여 생활 이미징 소프트웨어 (캘리퍼스 생명 과학)와 데이터를 분석 (ROI), 수동으로 뇌의 BLI 신호를 대략적으로 그려.
- 광자 카운트의 플롯 시간 코스 곡선 종양 hypoxia 역학을 나타낼 수 있습니다.
- 바로 지난 BLI 후, pimonidazole, hypoxia 마커 나중에 1 시간을 관리 쥐를 희생하고 두뇌를 해부하다. 최적의 절단 온도 (-10 월) -80에서 중간 및 동결 ° C의 냉장고에있는 모든 두뇌를 삽입할 수 있습니다. 이후 histological Cresyl 보라색 얼룩과 루시페라제, hypoxia 마커 pimonidazole에 대한 immunohistochemical 얼룩과 HIF - 1α는 영상 관찰을 검증하기 위해 수행.
4. 대표 결과 :
마찬가지로 Fig.1에 나타난, 상당히 높은 BLI 신호는 24 시간을위한 hypoxic 챔버 (1 % O 2) incubated transfected 세포 후에 관찰되었다. 약한 빛의 방출은 normoxia 아래의 제어 세포에서 관찰되었다. 이것은 HIF - 1α를 overexpress 수있는 세포 스트레스 신호를 유도 3 × 10 5 세포의 24 시간 문화 후 콩나물 세포 인구에서 발생할 수 있습니다. 그럼에도 불구하고, 생체내 BLI 결과 종양 hypoxia와 루시페라제 표현 사이 colocalization을 보여주 immunohistochemical 얼룩에 의해 확인되었다.
노출 시간의 자동 배열은 긴 노출 시간과 약한 신호의 포착을 용이하게 이미지의 시리즈, 그리고 포화 CCD없이 짧은 시간을 사용하여 강한 신호를 지속적으로 인수 가능합니다.
체외 HIF - 1α bioluminescence 분석에서는 그림 1 끝줄 :. 24 hypoxia 챔버에서 6 - 잘 요리 (0.1 % O 2)의 각 우물에 incubated 3 × 10 5 MDA-MB231/5HRE-ODD-luc 세포 HR은 매체 전에 제거 씻어 1 ML PBS로 대체되었습니다. 100 μl luciferin 각 우물에 추가되었습니다 직후, BLI는 노출 시간의 배열 (1, 30, 60, 180의)로 인수되었다. 강력한 발광은 대표적인 우물에서 관찰되었다 아래 행은 :. 컨트롤로서, 3 × 10 5 세포는 약한 빛을 방출 normoxia (21 % O 2)에 따라 incubated.
종양 hypoxia 역학의 생체내 bioluminescence 이미징 그림 2. 마우스 두뇌의 오른쪽부터) 약한 빛 신호는 먼저 시각 오주 MDA-MB231/5HRE-ODD-luc 유방암 세포 주입 후 intracranial되었다. 증가 광학 신호가 증가 종양의 hypoxia을 나타내는 추가 6주 동안 관찰했다. B) 줄거리는 빛의 신호의 양적 광자 카운트의 시간 코스 곡선을 보여주었다.
루시페라제 및 immunohisto - 화학 염색법에 의해 감지 hypoxia의 그림 3 Colocaliztion가. OCT에 포함된 유방암 MDA-MB231/5HRE-ODD-luc의 전이를 베어링 냉동 마우스 뇌가 sectioned되었습니다. 10 μm의 섹션, hypoxic 마커, pimonidazole와 immunostained 방지 루시페라제 염색법에 의해 감지 루시페라제 표현과 spatially 연관시키는 것은 발견 hypoxia의 intratumoral 이질을 공개했다. 스케일 바, 100 μm의.
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Discussion
유방암 뇌 전이는 단계 IV에서 유방암 환자의 30 %에서 발생합니다. 이것은 높은 병적 상태와 사망률과 관련하여 13개월 6 중앙값 생존을 가지고있다. 그 intracranial 개시 및 진행뿐만 아니라 pathophysiological 프로필에 대한 우리의 이해를 촉진하기 위해이 임상적으로 치명적인 질병을 모방하기 위해 적절한 동물 모델을 필요가있다. 여기, 우리는 직접 마우스 두뇌로 인간 유방암 세포를 주사하여 orthotopic 유방암 뇌 전이 모델을 개발했습니다. 우리의 이전 경험 radiologically 시각 (MRI에 의해) intracranial 병변은 약 2 주가 주입 후에 나타나는 것으로 나타났습니다. 이 직접 분사 모델에 대체, 우리는 최근 생쥐의 좌심실로 암 세포를 주사하여 다른 orthotopic 유방암 뇌 전이 모델을 만들 수 intracardiac 세포 주입 방식을 구현했습니다. 그러나, 뇌 metastases 쉬운 유방암 세포의 사전 선택이 모델 7 다중 초점 뇌 병변을 달성하기 위해 필요합니다. 우리는 최근 HRE 룩이 intracardiac 분사를 통해 마우스 머리로 전이 할 수있는 마우스 유방암 4T1 세포로 구성 동일을 도입했습니다.
Bioluminescence 이미징은 형광 이미징과 달리, 빛의 여기가 필요하지 않는, 매우 민감하고 효율적입니다. 이것은 본 연구에서는 설치류 모델에서 뿌리 깊은 종양의 이미징, 예, 마우스의 intracranial 뇌종양을 용이하게합니다. 세 또는 아직 5 생쥐는 동시에 몇 군데하실 수 있습니다. 그러나 가까이 카메라에 필요합니다 동물 위치를 설정 약한 신호가 온 몸이 이미지에 목격된 특히 감도를 증가. 이 경우에는 하나 또는 두 동물은 각 시간을 몇 군데하실 수 있습니다. 단층 이미지를 생성하는 방법이 있지만 BLI 중 하나는 제한이 해부학 낮은 공간 해상도입니다. 마이크로 - CT 또는 MR 영상과 공동 등록 제대로 해부학을 식별하는 데 도움 것입니다.
광범위한 노력은 생체내 8,9에서 종양 hypoxia을 모니터링하는 비침습 방법을 개발하기 위해 노력해왔다. 암 세포의 게놈에 hypoxia 리포터 유전자를 도입함으로써, 종양 hypoxia 진화의 길이 모니터링 광학 이미징 10,11으로 모니터링할 수 있습니다. 마찬가지로, 종양 hypoxia 역학 다음과 치료는이 접근법을 사용하여 모니터링할 수 있습니다.
루시페라제 및 기판뿐만 아니라, luciferin, 산소와 ATP가 빛을 생산하는 luciferin - 루시페라제 반응에 필수적인 요소입니다. hypoxic 환경에서 산소와 ATP 생산의 가용성 감소 빛을 방출 초래할 수있는, 상당히 제한될 수 있습니다. 그러나, 우리는 체외 BLI 분석에 MDA-231/HRE-luc 세포로 normoxic 상태 사람에 비해 훨씬 더 많은 빛을 방출 hypoxic 조건 (<0.1 % O 2)에 따라 incubated 것으로 나타났다. 또한, 종양 조직의 immunohistochemical 데이터 루시페라제 표현과 pimonidazole 사이 좋은 공간 상관 관계를 밝혔다. 이러한 관측 효율적인 조명 생산에 필요한 산소 농도와 ATP가 잘 포유 동물 세포를 생활에있는 그들의 수준 아래에있는 것으로 제시, 다른 이전 연구와 좋은 계약에 있습니다. 우리는 또한 굵은 기능성 MRI 접근법 (혈액 산소 수준에 따라 다름) 결합과 (의존 조직 산소 수준)이 모델의 평가 종양 hypoxia에 MRI 말했다. 비교 데이터가 multimodal 이미징 방법 (게시되지 않은 데이터)로부터 얻은되었습니다. 또한, immunohistochemical 얼룩은 hypoxic 종양 세포와 루시페라제 표현 세포의 colocaliztion 확인. 치료에 대한 응답으로 기준선 종양의 hypoxia과 역동적인 변화의 정확한 평가는 합리적인 치료 조합 12 수 있도록 하겠 군.
결론적으로, 저렴, 신속하고 고감도 BLI가 아닌 invasively 생체내에서 종양 hypoxia 역학을 평가하기위한 유용한 도구가 될 수 있습니다. orthotopic 뇌종양 모델이 연구에 사용하고있는 동안, 방법론은 확실히 설치류에 뿌리 깊은 orthotopic 종양 다른 유형의 적용할 수 있습니다.
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Disclosures
관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.
Acknowledgments
이 연구는 DOD 유방암 IDEA 수상에 의해 부분에서 지원됩니다 W81XWH - 08 - 1-0583 및 NIH / NCI CA141348 - 01A1 (DZ)와 FAMRI 임상 과학자 수상 (DS). 이미징 인프라 U24 CA126608와 시몬스 암 센터 (P30 CA142543)와 NIH 1S10RR024757 - 01에 의해 부분적으로 지원 남서 작은 동물 이미징 연구 프로그램에 의해 제공됩니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| D-luciferin | Gold Biotechnology | L-123 | 120 mg/kg in PBS in a total volume of 80 μl for in vivo study |
| Isoflurane | Baxter Internationl Inc. | 1001936060 | |
| Matrigel | BD Biosciences | 354234 | |
| Hamilton syringe | Hamilton Co | 1701 | |
| 32G Hamilton needle | Hamilton Co | 7803-04 | |
| Hypoxia chamber | Billups-Rothenberg, Inc. | MIC-101 | |
| Bioluminescence imaging system | Caliper Life Sciences | IVIS Spectrum system | |
| G418 | Fisher Scientific | SV3006901 |
References
- Harada, H. The combination of hypoxia-response enhancers and an oxygen-dependent proteolytic motif enables real-time imaging of absolute HIF-1 activity in tumor xenografts. Biochem Biophys Res Commun. 360, 791-796 (2007).
- Ou, G. Usefulness of HIF-1 imaging for determining optimal timing of combining bevacizumab and radiotherapy. Int J Radiat Oncol Biol Phys. 75, 463-467 (2009).
- Zhou, H. Dynamic near-infrared optical imaging of 2-deoxyglucose uptake by intracranial glioma of athymic mice. PLoS One. 4, e8051-e8051 (2009).
- Contero, A., Richer, E., Gondim, A., Mason, R. P. High-throughput quantitative bioluminescence imaging for assessing tumor burden. Methods Mol Biol. 574, 37-45 (2009).
- Zhao, D., Richer, E., Antich, P. P., Mason, R. P. Antivascular effects of combretastatin A4 phosphate in breast cancer xenograft assessed using dynamic bioluminescence imaging and confirmed by MRI. FASEB J. 22, 2245-2451 (2008).
- Chang, E. L., Lo, S. Diagnosis and management of central nervous system metastases from breast cancer. Oncologist. 8, 398-410 (2003).
- Palmieri, D. Vorinostat inhibits brain metastatic colonization in a model of triple-negative breast cancer and induces DNA double-strand breaks. Clin Cancer Res. 15, 6148-6157 (2009).
- Mason, R. P. Multimodality imaging of hypoxia in preclinical settings. Q J Nucl Med Mol Imaging. 54, 259-280 (2010).
- Tatum, J. L. Hypoxia: importance in tumor biology, noninvasive measurement by imaging, and value of its measurement in the management of cancer therapy. Int J Radiat Biol. 82, 699-757 (2006).
- Moeller, B. J. Pleiotropic effects of HIF-1 blockade on tumor radiosensitivity. Cancer Cell. 8, 99-110 (2005).
- Lu, X. In vivo dynamics and distinct functions of hypoxia in primary tumor growth and organotropic metastasis of breast cancer. Cancer Res. 70, 3905-3914 (2010).
- Zhao, D., Chang, C. H., Kim, J. G., Liu, H., Mason, R. P. In vivo Near-Infrared Spectroscopy and Magnetic Resonance Imaging Monitoring of Tumor Response to Combretastatin A-4-Phosphate Correlated With Therapeutic Outcome. Int J Radiat Oncol Biol Phys. 80, 574-581 (2011).
