Summary
低酸素誘導因子-1αの活性の生物発光イメージングは、乳がんの脳転移のマウスモデルにおける頭蓋内腫瘍の低酸素症の開発を監視するために適用されます。
Abstract
これはよく腫瘍低酸素症は悪性化を促進し、否定的に治療反応に影響を与える重要な役割を果たしていることが認識されている。 その場でについて少し知識がいるため、これらの根深い同所性腫瘍で、それを監視する効率的な手段の欠如の悪性脳腫瘍の頭蓋内開発中の腫瘍低酸素は、生体内で、ある。ルシフェラーゼ遺伝子を発現する生細胞により放出される光の検出に基づいて、生物発光イメージング（BLI）は、急速に臨床動物試験において、治療に応答して、腫瘍の成長または腫瘍サイズの変化を評価するために、特に、癌研究のために採用されています。また、プロモーター配列の制御下にレポーター遺伝子を発現させることにより、特定の遺伝子発現は、BLIによる非侵襲的に監視することができます。低酸素ストレス下では、シグナリング応答は、種々の遺伝子の転写を駆動するために主に低酸素誘導因子-1α（HIF -1α）を介して媒介されています。したがって、我々は、安定的にヒト乳癌MDA - MB231細胞（MDA-MB231/5HRE-ODD-luc）にトランスフェクションされたHIF -1αレポーター構築物、5HRE - ODD -ルシフェラーゼを、使用している。 体外 HIF -1α生物発光アッセイでによって実行される正常酸素状態の細胞（21％O 2）コントロールとして機能しながら、BLIの前に24時間のための低酸素室（0.1％O 2）にトランスフェクション細胞をインキュベートする。低酸素下細胞で観察された有意に高い光子フラックスは、正常酸素状態のものと比較して、そのプロモーターに増加HIF -1αの結合（HREの要素）を、示唆している。細胞は、乳がんの脳転移モデルを確立するためにマウスの脳に直接注入される。腫瘍低酸素動態の in vivo生物発光イメージングでは移植後2週齢を開始し、週に一度繰り返されます。 BLIは増加頭蓋内腫瘍の低酸素を示す、腫瘍が進行するように脳からの光信号を増加させる明らかにする。組織学的および免疫組織化学的研究は、in vivoイメージングの結果で確認するために使用されています。ここで、我々は、頭蓋内腫瘍の低酸素症を監視するために、in vivoで生物発光イメージングでのヌードマウスおよびアプリケーションにおける乳がんの脳転移の外科的確立をin vitroで HIF -1α生物発光アッセイでのアプローチを紹介します。
Protocol
すべての動物の手順は、テキサス大学南西医療センターの動物実験使用の委員会によって承認された。
（1）in vitroで HIF -1α生物発光アッセイで
- 材料と方法：
- 人間の転移性乳癌細胞株MDA - MB231は、新規なHIF - 1依存性レポーター遺伝子をトランスフェクション、5HRE - ODD - lucは博士原田によって生成されました。
- 低酸素状態では、酸素依存性分解ドメイン（ODD） - ルシフェラーゼ融合タンパク質の発現増強は、低酸素応答要素の5つのコピー（5HRE）によって駆動されます。 ODDの存在は、正常酸素条件下で極めて低いバックグラウンドのルシフェラーゼ活性の結果ODD - Lucのタンパク質の分解を引き起こす。したがって、この小説のシステムは、リアルタイムイメージングによる腫瘍内低酸素領域を検出するために使用することができます。この5HRE - ODD - lucの発現ベクターの構築は、原田らの1,2で報告されています。
- 正常酸素または低酸素下で培養細胞：
- 組換えMDA - MB231 1％グルタミン、G418および1％ペニシリン/ストレプトマイシン400μg/ mlの抗生物質を含有する10％ウシ胎児血清（FBS）- DMEM培地で細胞を維持する。
- 2つの6ウェルディッシュの各ウェルに5HRE - ODD - lucのベクターを発現体外 HIF -1αの生物発光アッセイ、プレート3 × 10 5 MDA - MB231細胞について。
- 正常酸素状態（21％O 2）の下に他の料理を維持しながら細胞は、一晩インキュベーションした後、シャーレの壁を添付して、低酸素症研究のための低酸素室（ラップス-ローゼンバーグ、（株）デルマー、CA）中に一皿を転送することができます。
- ガスシリンダーで吸気ポートのチューブを接続し、0.1％O 2とチャンバーとガスチャンバーを組み立てます。
注：どちらの入口と出口ポートのクランプはこの手順の実行中に開いている必要があります。 - チャンバーはプラスチック製のクランプを閉じることによりパージし、シール室された後、ガス源を外します。
- 5％CO 2で37℃インキュベーターでチャンバーを配置。
注：チャンバーは、文化の過度の蒸発を防ぐために加湿する必要があります。チャンバー内に20 mlの滅菌水 - これは、10を配置することによって達成することができます。
- 生物発光アッセイ：
- 24時間のインキュベーション後、培地を除去し、氷冷PBS（2X）で迅速に細胞を洗浄。
- ルシフェリン100μlの（ゴールドのバイオテクノロジー、セントルイス、MO）で冷PBSを1 mlを追加。
- 様々な露光時間（1、30、60、180秒）とBLの画像を（IVISスペクトラムシステム、キャリパーライフサイエンス、ホプキントン、MA）取得。
- よくリビングイメージのソフトウェアを（キャリパーライフサイエンス）を用いてそれぞれの光強度を測定する。
2。乳がんの脳転移モデルの確立
- MDA-MB231/5HRE-ODD-luc細胞の調製
- 10％FBS、1％グルタミン、1％ペニシリン/ストレプトマイシンを含むデーム培地でMDA-MB231/5HRE-ODD-luc細胞を取得し、文化。
- 2〜3日ごとに培地を交換してください。 Tripsinizeと彼らは80％コンフルエントに達したときに細胞を洗浄。
- 適切な数の細胞をカウントし、4μlの体積で10 5細胞の最終濃度で25％マトリゲル（BD Biosciences社、サンノゼ、カリフォルニア州）で無血清デームの培地で再懸濁します。
- 頭蓋内注射の前に氷の上に置いて細胞。
- 外科的移植
- 雌のヌードマウス（BALB / cのNU / NU、国立がん研究所、ベセスダ、MD）4-6週齢では、本研究で使用されています。
- 麻酔（誘導チャンバ内のO2 /イソフルラン3％、バクスターインターナショナルインク、ディアフィールド、イリノイ州、アメリカ合衆国イソフルラン）と酸素（1 DM 3 /分）で（1％）イソフルラン外科的処置3の間で動物を維持する。
- 右頭頂皮はbetadineしてから、前の切開〜70％アルコールで整形処理されるべきである。
- 高速ドリルを使用して、バリ冠状縫合とsaggital縫合の外側2 mmまでの頭蓋骨が1mm前方の右半球で1mmの穴。
- 4μlの細胞混合物（10 5細胞）を10μlハミルトンシリンジ（ハミルトン社、リノ、ネバダ州）を使用してを描く。 、右尾間脳に直接細胞を注入するカスタムメイドの32Gハミルトンの針を用いて硬膜の下に1.5ミリメートル。撤退前に約30秒のための場所に針をしてください。 32G細針の使用法は、組織の損傷を最小限に抑えます。
- 骨のワックスとバリ穴を埋めると吸収性縫合糸で頭皮を閉じます。
- 70％アルコールで切開領域を準備します。
- ブプレノルフィン鎮痛を2日間ごとに12時間を適用します。
（3）乳がんの脳転移の腫瘍低酸素動態の in vivo生物発光イメージングで
- 8のために週に一度二週間頭蓋内移植し、繰り返しの後に縦生物発光イメージング（IVISスペクトラムシステム）を開始-10週。
- 一度に3匹のマウスを麻酔（イソフルラン3％/誘導チャンバ内のO 2）
- 詳細以前に4で説明したように、各マウスの頸部皮下に、D -ルシフェリンの溶液（ゴールドバイオ溶液80の全体積のPBSで120ミリグラム/ kg）の管理。
D -ルシフェリンは、非毒性であり、無傷の血液脳関門（BBB）と細胞膜3,5を貫通することが可能であることが示されている。
- イメージングチャンバー内に3匹のマウスを置き、撮像中に（1 DM 3 /分）酸素（1％）イソフルランで維持した。
- ルシフェリンの投与後5分後には、様々な露出時間の配列（1、30、60、180秒）とBLの画像を取得する。
我々の観察では、ピーク発光時間は頸部3,4のルシフェリンの皮下投与後5分程度であることを示している。
- 興味のある領域で絶対的な光子計数（フォトン/ s）を使用してリビングのイメージングソフトウェア（キャリパーライフサイエンス）でデータを分析（ROI）、手動で脳のBLI信号の輪郭を描く。
- 腫瘍低酸素のダイナミクスを示すために、光子カウントのプロットの時間経過の曲線。
- すぐに最後のBLIの後、後pimonidazole、低酸素マーカーと1時間を管理する、マウスを犠牲にして脳を解剖。最適な切削温度（OCT）-80の培地と凍結℃の冷凍庫で全体の頭脳を埋め込みます。その後の組織学的クレシルバイオレット染色とルシフェラーゼ、低酸素マーカーpimonidazoleに対する免疫組織化学的染色、およびHIF -1αは、撮像観測を検証するために行った。
4。代表的な結果：
図1に示すように、有意に高いBLIの信号は、24時間のための低酸素室（1％O 2）中でインキュベートしたトランスフェクションした細胞の後に観察された。弱い発光が正常酸素下での制御細胞から観察された。これは、HIF -1αを過剰発現する細胞にストレスのシグナルを誘導した3 × 10 5細胞、24時間培養後の過密な細胞集団から発生する可能性があります。それにもかかわらず、 生体 BLIの結果では腫瘍の低酸素症とルシフェラーゼ発現との間の共局在を示す免疫組織化学的染色によって検証した。
露光時間の自動化された配列は、より長い露光時間で弱い信号の捕捉を容易にする一連のイメージ、および飽和CCDなく、短い時間を使って強力な信号の連続的な買収が可能になります。
in vitroで HIF -1α生物発光アッセイでは図1上段：24のために低酸素室内の6ウェルディッシュ（0.1％O 2）の各ウェル中でインキュベート3 × 10 5 MDA-MB231/5HRE-ODD-luc細胞時間はメディアの前に、除去洗浄し、1mlのPBSに置換した。 100μlのルシフェリンを各ウェルに添加した直後に、BLIは、露光時間の配列（1、30、60、180秒）で買収された。強い発光は、代表的な井戸から観察された下行：。対照として、正常酸素状態（21％O 2）放射される微弱な光の下でインキュベート3 × 10 5細胞。
マウス脳の右側から腫瘍低酸素のダイナミクスの in vivo生物発光イメージングで図2。）微弱な光信号は、最初の5週間MDA-MB231/5HRE-ODD-luc乳癌細胞の頭蓋内移植後に可視化した。増加した光信号は、腫瘍の低酸素症を示し、追加の6週間にわたって観察された。B）のプロットは、光信号の定量的な光子計数の時間的経過の曲線を示した。
免疫組織化学染色によって検出されたルシフェラーゼと酸素の図3 Colocaliztion。OCTで埋め込 まれた乳がんMDA-MB231/5HRE-ODD-lucの転移が付いた冷凍マウスの脳には、切片いた。 10μmのセクションでは、低酸素マーカー、pimonidazoleを用いて免疫染色抗ルシフェラーゼ染色によって検出されたルシフェラーゼ発現を空間的に相関することが発見された低酸素の腫瘍内不均一性を、明らかにした。スケールバー、100μmである。
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Discussion
乳がんの脳転移は、IV期では乳癌患者の30％で発生します。それは、高い罹患率と死亡率と関連しており、13ヶ月6の生存期間の中央値を持っています。その頭蓋の発生および進行だけでなく、病態生理学的プロファイルの我々の理解を容易にするために、この臨床的に壊滅的な疾患を模倣するために適切な動物モデルを持っている必要があります。ここで、我々は、直接マウスの脳に、ヒト乳癌細胞を注入することにより、同所性乳癌の脳転移モデルを開発した。私たちの以前の経験では、放射線学的に可視化（MRIによる）頭蓋内病変は約2週間移植後に表示されることが示されている。この直噴モデルの代わりに、我々は最近、マウスの左心室に癌細胞を注入することにより、別の同所性乳癌の脳転移モデルを作成するには、心臓内の細胞の注入のアプローチを実施しています。しかし、脳転移を起こしやすい乳癌細胞の事前選択は、このモデル7でマルチ局所性脳病変を達成するために必要です。我々は最近、心臓内注射によりマウスの脳に転移することができるマウスの乳癌4T1細胞に同じHRE - lucを構築体を導入している。
生物発光イメージングは、蛍光イメージングとは異なり、光の励起を必要としない、、高感度と効率的です。これは、この研究では齧歯類モデルの深い腫瘍のイメージング、 例えば 、マウスの頭蓋内の脳の腫瘍を促進する。さらには3または5匹のマウスを同時に撮像することができます。しかし、カメラに近い必要となる動物の位置を設定し、弱い信号が全身像で見られた特に感度を増加させる。このケースでは、1つまたは2つの動物は、それぞれの時間を画像化することができます。断層画像を生成するためのメソッドが存在するものの、BLIの制限の一つは、解剖学の低空間分解能である。マイクロCTまたはMR画像との共同登録が適切に解剖学的構造を識別するために支援します。
大規模な努力がin vivoで 8,9 の腫瘍低酸素症を監視する非侵襲的なアプローチを開発するために求められている。がん細胞のゲノムに低酸素レポーター遺伝子を導入することにより、腫瘍低酸素の進化の長手方向の監視は、光学イメージング10,11によって監視することができます。同様に、腫瘍低酸素のダイナミクスは、次の治療は、このアプローチを使用して監視できます。
ルシフェラーゼおよびその基質に加えて、ルシフェリン、酸素およびATPは光を生成するために、ルシフェリン - ルシフェラーゼ反応に不可欠な要素です。低酸素環境では、酸素およびATP生産の可用性が低下発光の発生が想定され大幅に制限されることがあります。しかし、私たちは 、in vitro BLIアッセイで MDA-231/HRE-luc細胞がとして正常酸素状態のものに比べて、はるかに多くの光を放出される低酸素状態（<0.1％O 2）でインキュベートすることを示した。また、腫瘍組織の免疫組織化学的データは、ルシフェラーゼ発現とpimonidazoleの間に良好な空間相関を明らかにした。これらの観察は、効率的な光の生産に必要な酸素濃度とATPがよく、哺乳動物細胞を生体内で見られるそれらのレベルを下回っていることを示唆し、他のユーザーが以前の研究とよく一致している。我々はまた、BOLD、機能的MRIのアプローチを、（血中酸素レベル依存）組み合わせると（依存組織酸素レベル）このモデルで評価した腫瘍低酸素症にMRIを言っておく。比較可能なデータは、マルチモーダルイメージングのアプローチ（未発表データ）から得られている。また、免疫組織化学染色は、低酸素腫瘍細胞とルシフェラーゼ発現細胞のcolocaliztionを確認した。ベースラインの腫瘍の低酸素症と治療への反応のダイナミックな変化の正確な評価は、合理的な治療の組み合わせ12を可能にするはずである。
結論として、安価、迅速かつ高感度BLIは、非侵襲的に生体内で腫瘍低酸素動態を評価する際に便利なツールです。同所性脳腫瘍モデルは、本研究で使用されているが、方法論は、確かにげっ歯類では根深い同所性腫瘍の他のタイプに適用することができます。
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Disclosures
利害の衝突は宣言されません。
Acknowledgments
本研究では、DOD乳がんのIDEA賞W81XWH - 08 - 1から0583までおよびNIH / NCI CA141348 - 01A1（DZ）とFAMRI臨床科学者賞（DS）によって部分的にサポートされています。イメージングインフラストラクチャは、U24 CA126608とシモンズがんセンター（P30 CA142543）とNIH 1S10RR024757 - 01によって部分的にサポートされている南西部の小動物のイメージング研究プログラムによって提供されます。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| D-luciferin | Gold Biotechnology | L-123 | 120 mg/kg in PBS in a total volume of 80 μl for in vivo study |
| Isoflurane | Baxter Internationl Inc. | 1001936060 | |
| Matrigel | BD Biosciences | 354234 | |
| Hamilton syringe | Hamilton Co | 1701 | |
| 32G Hamilton needle | Hamilton Co | 7803-04 | |
| Hypoxia chamber | Billups-Rothenberg, Inc. | MIC-101 | |
| Bioluminescence imaging system | Caliper Life Sciences | IVIS Spectrum system | |
| G418 | Fisher Scientific | SV3006901 |
References
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