Summary
Imágenes de bioluminiscencia de inducible por hipoxia-1α factor de actividad se aplica al seguimiento del desarrollo de la hipoxia tumoral intracraneal en un modelo de ratón de cáncer de mama metástasis cerebrales.
Abstract
Es bien sabido que la hipoxia tumoral juega un papel importante en la promoción de la progresión maligna y que afectan negativamente a la respuesta terapéutica. Existe poco conocimiento sobre el terreno, en la hipoxia in vivo, durante el desarrollo del tumor intracraneal de tumores cerebrales malignos debido a la falta de medios eficaces para su seguimiento en estos tumores ortotópico profunda. Imágenes de bioluminiscencia (BLI), basado en la detección de la luz emitida por las células vivas que expresan un gen de la luciferasa, ha sido adoptado rápidamente por la investigación del cáncer, en particular, para evaluar el crecimiento del tumor o cambio el tamaño del tumor en respuesta al tratamiento en estudios preclínicos en animales. Por otra parte, al expresar un gen bajo el control de una secuencia promotora, la expresión de genes específicos pueden ser monitoreados de forma no invasiva por BLI. En situaciones de estrés hipóxico, las respuestas de señalización están mediados principalmente por el factor inducible por hipoxia 1α (HIF-1α) para conducir la transcripción de varios genes. Por lo tanto, hemos utilizado un reportero construir HIF-1α, 5HRE-ODD-luc, transfectadas establemente en el cáncer de mama humano MDA-MB231 (MDA-MB231/5HRE-ODD-luc). Ensayo in vitro de HIF-1α bioluminiscencia es realizada por incubación de las células transfectadas en una cámara de hipoxia (0,1% O 2) durante 24 horas antes de BLI, mientras que las células en normoxia (21% O 2) servir como un control. Flujo de fotones observados significativamente mayor para las células en condiciones de hipoxia sugiere un aumento de HIF-1α unirse a su promotor (elementos HRE), en comparación con los de normoxia. Las células se inyectan directamente en el cerebro del ratón para establecer un cáncer de mama cerebro modelo de metástasis. En imágenes de bioluminiscencia in vivo de la dinámica de la hipoxia tumoral se inicia dos semanas después de la implantación y repitió una vez por semana. BLI revela aumento de las señales de luz desde el cerebro a medida que avanza tumor, lo que indica la hipoxia aumentó tumor intracraneal. Estudio histológico e inmunohistoquímico se utilizan para confirmar los resultados de las imágenes en vivo. Aquí, vamos a introducir los enfoques de análisis in vitro de HIF-1α bioluminiscencia, la creación quirúrgica de una metástasis de mama cáncer cerebral en un ratón desnudo y la aplicación de imágenes de bioluminiscencia en vivo para controlar la hipoxia tumoral intracraneal.
Protocol
Todos los animales procedimientos fueron aprobados por el Cuidado de Animales institucional y el empleo de la Universidad de Texas, Centro Médico del Sudoeste.
1. En el ensayo in vitro de HIF-1α bioluminiscencia
- Material y métodos:
- Humanas de cáncer de mama metastásico línea celular MDA-MB231 transfectadas con un gen novedoso HIF-1-dependiente, 5HRE-ODD-luc fue generada por el Dr. Harada.
- En condiciones de hipoxia, la mayor expresión de dominio degradación dependiente de oxígeno (ODD)-luciferasa proteína de fusión se debe a cinco copias del elemento de respuesta a la hipoxia (5HRE). La presencia de ODD provoca la degradación del ODD-Luc proteína resultante en muy baja actividad de la luciferasa de fondo en condiciones normoxic. Por lo tanto, este novedoso sistema se puede utilizar para detectar las regiones de hipoxia en un tumor de imagen en tiempo real. La construcción de este vector de expresión 5HRE-ODD-luc ha sido reportado por Harada et al 1,2.
- Las células de cultivo en normoxia o hipoxia:
- Mantener la recombinante MDA-MB231 células en suero fetal bovino al 10% (FBS)-DMEM medio que contiene una glutamina%, los antibióticos de 400 mg / ml de G418 y el 1% penicilina / estreptomicina.
- Para el análisis in vitro de HIF-1α bioluminiscencia, la placa de 3 x 10 5 MDA-MB231 células que expresan 5HRE-ODD-luc vector en cada pocillo de dos períodos de seis platos así.
- Permiten a las células para fijar el plato de la pared después de incubación durante la noche y luego transferir un plato en una cámara de hipoxia (Billups-Rothenberg, Inc. Del Mar, CA) para los estudios de hipoxia, mientras que mantener el plato otra en condiciones normoxic (21% O 2).
- Volver a montar la cámara y la cámara de gas con un 0,1% de O 2 mediante la conexión de la tubería de conexión de entrada con un cilindro de gas.
Nota: Los dos de entrada y salida de las abrazaderas puerto debe estar abierto durante este procedimiento. - Desconecte la fuente de gas después de la cámara se ha purgado y la cámara del sello por el cierre de las abrazaderas de plástico.
- Coloque la cámara en una incubadora a 37 ° C con 5% de CO 2.
Nota: La cámara debe estar húmeda para evitar la evaporación excesiva de las culturas. Esto se puede lograr mediante la colocación de 10 a 20 ml de agua estéril en la cámara.
- Bioluminiscencia ensayo:
- Después de la incubación de 24 horas, se elimina el medio y lavar las células rápidamente con PBS enfriado con hielo (2X).
- Añadir 1 ml de PBS frío con 100 l de luciferina (Biotecnología de Oro, St Louis, MO).
- BL adquirir imágenes (sistema IVIS Spectrum, Caliper Life Sciences, Hopkinton, MA) con tiempos de exposición diferentes (1, 30, 60, 180 s).
- Medir la intensidad de la luz en cada pozo usando el software Image Vivir (Caliper Life Sciences).
2. Establecimiento de un modelo de cáncer de mama metástasis cerebral
- Preparación de las células MDA-MB231/5HRE-ODD-luc
- Recuperar y cultivar las células en un medio de MDA-MB231/5HRE-ODD-luc DEME que contiene 10% de SFB, 1% y glutamina 1% de penicilina / estreptomicina.
- Vuelva a colocar el medio cada 2-3 días. Tripsinize y lavar las células cuando llegan a 80% de confluencia.
- Contar el número apropiado de células y resuspender en medio sin suero DEME libres con un 25% Matrigel (BD Biosciences, San Jose, CA) con una concentración final de 10 5 células en 4 l de volumen.
- Células de lugar en el hielo antes de la inyección intracraneal.
- Implantación quirúrgica
- Mujer ratones desnudos (BALB / c nu / nu; Instituto Nacional del Cáncer, Bethesda, MD) a las 4-6 semanas de edad son utilizados en este estudio.
- Anestesiar (3% isoflurano / O2 en una cámara de inducción; isoflurano de Baxter International Inc., Deerfield, IL, EE.UU.) y mantener a los animales con isoflurano (1%) en oxígeno (1 dm 3 / min) durante el procedimiento quirúrgico 3.
- La piel parietal derecho debe ser preparado con betadine y alcohol al 70% antes de la incisión.
- El uso de un taladro de alta velocidad, una fresa agujero de 1 mm en el hemisferio derecho del cráneo, 1 mm por delante de la sutura coronal y 2 mm lateral a la sutura sagital.
- Dibuja 4 l mezcla de células (10 5 células), utilizando una jeringa de 10 l Hamilton (Hamilton Company, Reno, NV). Inyectar las células directamente en el derecho diencéfalo caudal, 1,5 mm por debajo de la duramadre con una medida 32G aguja Hamilton. Mantenga la aguja en su lugar durante unos 30 s antes de la retirada. El uso de una aguja fina 32G minimiza el daño tisular.
- Llenar el agujero de trépano con cera de hueso y cerca del cuero cabelludo con suturas absorbibles.
- Preparar a la región de la incisión con alcohol al 70%.
- Aplicar la buprenorfina analgesia cada 12 horas durante dos días.
3. En imágenes de bioluminiscencia in vivo de tumores dinámica de la hipoxia en las metástasis cerebrales del cáncer de mama
- Iniciar imágenes de bioluminiscencia longitudinal (sistema IVIS Spectrum) dos semanas después de la implantación intracraneal y repetir una vez por semana durante 8-10 Semanas.
- Anestesiar a tres ratones en un momento (3% isoflurano / O 2 en una cámara de inducción)
- Administrar una solución de D-luciferina (120 mg / kg en PBS en un volumen total de 80 l; Biotecnología de oro) por vía subcutánea en la región del cuello de cada ratón como se describe en detalle anteriormente 4.
D-luciferina no es tóxico y se ha demostrado que es capaz de penetrar intacta la barrera hematoencefálica (BBB) y las membranas celulares 3,5.
- Lugar el 3 ratones en la cámara de imágenes y mantenida con isoflurano (1%) en oxígeno (1 dm 3 / min) durante la exploración.
- Cinco minutos después de la inyección luciferina, BL adquirir imágenes con una serie de tiempo de exposición diferentes (1, 30, 60, 180 s).
Nuestras observaciones muestran que el tiempo máximo de emisión de luz es cerca de 5 minutos tras la administración subcutánea de la luciferina en la región del cuello 3,4.
- Analizar los datos con el software de imágenes de vida (Caliper Life Sciences) con el recuento absoluto de fotones (fotones / s) en una región de interés (ROI), dibujado manualmente para delinear la señal de BLI del cerebro.
- Tiempo de trama curva curso de cuenta de fotones para indicar la dinámica de tumor hipoxia.
- Inmediatamente después de la última BLI, administrar pimonidazole, el marcador de hipoxia y una hora más tarde, el sacrificio de los ratones y diseccionar el cerebro. Insertar el cerebro entero en la temperatura óptima de corte (OCT) de mediano y congelación de -80 ° C congelador. Posterior tinción histológica violeta de cresilo y tinción inmunohistoquímica contra la luciferasa, marcador de hipoxia pimonidazole, y HIF-1α-realizado para validar las observaciones de imágenes.
4. Los resultados representativos:
Como se muestra en la Figura 1, significativamente mayor señal de BLI se observó después de las células transfectadas se incubaron en la cámara de hipoxia (1% O 2) durante 24 horas. La emisión de luz débil se observó en las células de control en normoxia. Esto puede deberse a la población de células hacinamiento después de la cultura de 24 horas de 3 x 10 5 células, lo que indujo una señal de tensión a las células de HIF-1α sobreexpresan. Sin embargo, los resultados in vivo BLI fueron validados por tinción inmunohistoquímica mostrando colocalización entre la hipoxia tumoral y la expresión de la luciferasa.
Una serie de tiempos de exposición automático permite la adquisición continua de una serie de imágenes, lo que facilita la captura de una señal débil con mayor tiempo de exposición, y las señales de fuerte uso de un tiempo más corto sin saturar el CCD.
Figura 1 Ensayo in vitro de HIF-1α bioluminiscencia Fila superior:. 3 x 10 5 células se incubaron en MDA-MB231/5HRE-ODD-luc cada pocillo de una 6-y-placa en una cámara de hipoxia (0,1% O 2) por 24 horas antes de que se retiró el medio, se lavan y se sustituye por 1 ml de PBS. Inmediatamente después de 100 l luciferina se añadió en cada pozo, BLI fue adquirido con una serie de tiempos de exposición (1, 30, 60, 180 s). Luminiscencia fuerte se observó en los pozos representante Fila inferior:. Como control, 3 x 10 5 células se incubaron en normoxia (21% O 2) emite luz débil.
En la figura 2 imágenes de bioluminiscencia in vivo de la dinámica de la hipoxia tumoral. A) una señal de luz débil del lado derecho del cerebro de los ratones fue el primero en visualizar cinco semanas después de la implantación intracraneal MDA-MB231/5HRE-ODD-luc de las células de cáncer de mama. Aumento de la señal óptica se observó durante otras 6 semanas, lo que indica un aumento hipoxia tumoral. B) La figura muestra la curva de evolución en el tiempo de recuento de fotones cuantitativo de la señal de la luz.
Figura 3 Colocaliztion de la luciferasa y la hipoxia detectada por tinción inmunohistoquímica. Un cerebro de un ratón congelado que lleva una metástasis de cáncer de mama MDA-MB231/5HRE-ODD-luc incrustado en octubre se seccionó. Una sección de 10 m immunostained con un marcador de hipoxia, pimonidazole, reveló la heterogeneidad intratumoral de la hipoxia, que se correlaciona espacialmente con expresión de la luciferasa detectados por los anti-manchas luciferasa. Barra de escala, 100 micras.
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Discussion
El cáncer de mama metástasis cerebral se produce en el 30% de los pacientes con cáncer de mama en etapa IV. Se asocia con una elevada morbilidad y mortalidad y tiene una supervivencia media de 13 meses 6. Es necesario disponer de modelos animales apropiados para imitar esta enfermedad clínicamente devastadoras para facilitar la comprensión de su inicio y la progresión intracraneal, así como los perfiles de fisiopatológicas. En este caso, hemos desarrollado un cáncer de mama ortotópico modelo de metástasis cerebrales mediante la inyección de células humanas de cáncer de mama, directamente en el cerebro del ratón. Nuestras experiencias anteriores han demostrado que una radiológicamente visualizar (por resonancia magnética) lesión intracraneal aparece aproximadamente 2 semanas después de la implantación. Alternativa a este modelo de inyección directa, recientemente hemos implementado un método de células inyección intracardíaca para crear otro tipo de cáncer de mama ortotópico modelo de metástasis cerebrales mediante la inyección de células cancerosas en el ventrículo izquierdo del ratón. Sin embargo, la pre-selección de metástasis cerebrales propensos a las células del cáncer de mama es necesario para lograr múltiples lesiones focales cerebrales en este modelo 7. Recientemente hemos introducido la misma educación en derechos humanos-luc construir en las células del cáncer de mama del ratón 4T1 que son capaces de hacer metástasis en el cerebro de ratones mediante la inyección intracardíaca.
Imágenes de bioluminiscencia es muy sensible y eficiente, lo que, a diferencia de imágenes de fluorescencia, no necesita luz de excitación. Esto facilita la obtención de imágenes de tumores profundos en modelos de roedores, por ejemplo, los tumores cerebrales intracraneales del ratón en este estudio. Tres o incluso cinco ratones se pueden visualizar al mismo tiempo. Sin embargo, para aumentar la sensibilidad sobre todo cuando la señal es débil se ve en la imagen de todo el cuerpo, el establecimiento de la posición de los animales cerca de la cámara será necesario. En este caso, sólo uno o dos animales se pueden obtener imágenes cada vez. Una limitación de BLI es de baja resolución espacial de la anatomía, aunque hay métodos para generar imágenes tomográficas. Co-registro con micro-TC o RM sería de utilidad para identificar correctamente la anatomía.
Grandes esfuerzos se han tratado de desarrollar procedimientos no invasivos para controlar la hipoxia tumoral in vivo 8,9. Mediante la introducción de un gen reportero hipoxia en el genoma de las células cancerosas, el seguimiento longitudinal de la evolución de la hipoxia tumoral puede ser monitoreado por imágenes ópticas 10,11. Del mismo modo, la hipoxia tumoral tratamiento siguientes dinámicas pueden ser monitoreados utilizando este enfoque.
Además de la luciferasa y su sustrato, la luciferina, el oxígeno y ATP son elementos indispensables en la reacción luciferina-luciferasa para producir luz. En el ambiente hipóxico, la disponibilidad de oxígeno y la producción de ATP puede ser significativamente limitada, lo cual podría resultar en la emisión de luz reducida. Sin embargo, nuestro ensayo in vitro de BLI mostraron que las células se incubaron en MDA-231/HRE-luc condición de hipoxia (<0,1% O 2) emite mucho más ligero, en comparación con aquellos en condiciones normoxic. Además, los datos de inmunohistoquímica de los tejidos tumorales reveló una buena correlación espacial entre la expresión de la luciferasa y pimonidazole. Estas observaciones están en un buen acuerdo con estudios previos realizados por otros, lo que sugiere que la concentración de oxígeno y ATP necesarios para la producción eficiente de la luz están muy por debajo de sus niveles de vida se encuentran en células de mamíferos. También hemos combinado los enfoques funcional MRI, BOLD (nivel de oxígeno en la sangre depende) y le dijo (a nivel tisular de oxígeno dependiente) de resonancia magnética para evaluar la hipoxia tumoral en este modelo. Datos comparables se han obtenido a partir de los enfoques de imagen multimodal (datos no publicados). Por otra parte, la tinción inmunohistoquímica confirmó colocaliztion de las células tumorales hipóxicas y células que expresan luciferasa. La evaluación precisa de la hipoxia del tumor inicial y los cambios dinámicos en la respuesta al tratamiento debería permitir 12 racional combinación terapéutica.
En conclusión, el BLI barato, rápido y altamente sensible puede ser una herramienta útil para evaluar de forma no invasiva del tumor dinámica de la hipoxia en vivo. Mientras que el modelo ortotópico de tumor cerebral se ha utilizado en este estudio, la metodología ciertamente se puede aplicar para otros tipos de tumores profundos ortotópico en los roedores.
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Disclosures
No hay conflictos de interés declarado.
Acknowledgments
Este estudio es financiado en parte por el Departamento de Defensa premio IDEA de Cáncer de Mama W81XWH-08-1-0583 y la NIH / NCI CA141348-01A1 (DZ) y FAMRI premio científico clínico (DS). Infraestructura de imagen se proporciona por el Programa de Pequeños Animales del Suroeste de Investigación de imagen apoyado en parte por U24 CA126608 y Simmons Cancer Center (P30 CA142543) y NIH 1S10RR024757-01.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| D-luciferin | Gold Biotechnology | L-123 | 120 mg/kg in PBS in a total volume of 80 μl for in vivo study |
| Isoflurane | Baxter Internationl Inc. | 1001936060 | |
| Matrigel | BD Biosciences | 354234 | |
| Hamilton syringe | Hamilton Co | 1701 | |
| 32G Hamilton needle | Hamilton Co | 7803-04 | |
| Hypoxia chamber | Billups-Rothenberg, Inc. | MIC-101 | |
| Bioluminescence imaging system | Caliper Life Sciences | IVIS Spectrum system | |
| G418 | Fisher Scientific | SV3006901 |
References
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