La cuantificación de la actividad agonista en el G receptores acoplados a proteínas

Summary

Un método para estimar la constante de afinidad de un agonista para el estado activo (

Abstract

Cuando un agonista activa una población de G receptores acoplados a proteínas (GPCRs), que provoca una vía de señalización que culmina en la respuesta de la célula o tejido. Este proceso puede ser analizado a nivel de un solo receptor, con una población de receptores, o una respuesta abajo. A continuación se describe la forma de analizar la respuesta de abajo para obtener una estimación de la afinidad agonista constante para el estado activo de los receptores individuales.

Receptores se comportan como interruptores cuánticos que se alternan entre los estados activos e inactivos (Figura 1). El estado activo interacciona con las proteínas G específica u otros socios de señalización. En ausencia de ligandos, el estado inactivo predomina. La unión de agonistas aumenta la probabilidad de que el receptor pasará al estado activo, porque su constante de afinidad para el estado activo (K _b) es mucho mayor que para el estado inactivo (K _a). La suma de lossalidas al azar de todos los receptores en la población de los rendimientos de un nivel constante de activación de los receptores en el tiempo. El recíproco de la concentración del agonista de la mitad de la máxima provocar la activación del receptor es equivalente a la constante de afinidad observada (K _obs), y la fracción de los complejos agonista de los receptores en el estado activo se define como la eficacia (ε) (Figura 2).

Métodos para el análisis de las respuestas aguas abajo de GPCRs han sido desarrollados, que permiten la estimación de la K _obs y la eficacia relativa de un ^1,2 agonista. En este informe, se muestra cómo modificar este análisis para estimar el valor de _b agonistas K respecto a la de otro agonista. Para los ensayos que muestran actividad constitutiva, se muestra cómo estimar K _b en unidades absolutas de ^M-1.

Nuestro método de análisis de agonista curvas concentración-respuesta consiste en ^3,4de regresión no lineal utilizando mundial el modelo de operación ^5. Se describe un procedimiento a través de la aplicación de software, Prism (GraphPad Software, Inc., San Diego, CA). El análisis se obtiene una estimación del producto de K _obs y un parámetro proporcional a la eficacia (τ). La estimación de τK _obs de un agonista, dividido por el de otro, es una medida relativa de K _b (AR _I) ^6. Para cualquier receptor exhiben una actividad constitutiva, es posible estimar un parámetro proporcional a la eficacia del complejo de receptores libres (τ _sistema). En este caso, el valor de K _b de un agonista es equivalente a τK _obs / τ _sistema ^3.

Nuestro método es útil para determinar la selectividad de un agonista de los subtipos de receptores y para cuantificar el agonista del receptor de señalización a través de diferentes proteínas G.

Protocol

1. La medición de agonista curvas concentración-respuesta: no hay actividad constitutiva

1. Para la estimación de los valores relativos de agonistas K _b (RA _i), una serie de al menos dos agonistas de curvas concentración-respuesta se requiere. Cualquier ensayo in vitro de la respuesta funcional de un GPCR puede ser medido, siempre que la concentración de agonista puede ser controlado y un solo tipo de receptor media la respuesta. Adecuados ensayos basados ​​en células incluyen la medición de ^4,7 y la acumulación de AMPc inositolfosfato ^8,9 en una línea de células que expresan un receptor recombinante. Ejemplos de ensayos de todo el tejido incluyen la medición de la contracción del músculo liso ^{de 10} o _M-2 de los receptores muscarínicos y β _{1-adrenérgicos} mediada por alteraciones de la contracción de la rata de campo estimuló la aurícula izquierda ^11.
2. Elija una serie de agonistas para el análisis como un agonista altamente eficaz(Por ejemplo, ligando, endógena). En un experimento dado, medida completa curvas concentración-respuesta para cada agonista. Si el número de agonistas es demasiado grande para completar el ensayo en un solo experimento, se dividen los agonistas en subgrupos, cada uno con un número manejable de los agonistas de un solo experimento. Para cada subgrupo, medir la curva concentración-respuesta del agonista altamente eficaces, junto con las de los otros agonistas en el subgrupo (ver Figura 3). Repita el experimento para cada subgrupo de 3 a 6 veces, aproximadamente, dependiendo de la variabilidad de los datos.
3. Para cada curva concentración-respuesta, medir la respuesta en ausencia del agonista (respuesta basal), y en presencia de concentraciones crecientes del agonista. Espacio de las concentraciones de agonista de manera uniforme en una escala logarítmica aproximadamente cada 0,3 a 0,7 log ₁₀ unidades, que cubren la gama de respuestas y la definición de la respuesta máxima (E _max) (ver Figura 3). Para experimlos padres sobre las líneas celulares, cada medición se realizó por triplicado.
4. Resta la respuesta basal de la que se mide en la presencia de cada concentración de agonista. Las respuestas presentan en la Figura 3 se calcula de esta manera.

2. El análisis preliminar de agonista curvas concentración-respuesta: no hay actividad constitutiva

1. Introduzca los datos de los experimentos de concentración-respuesta (por ejemplo, la Figura 5) en una tabla de datos en Prism. Todas las concentraciones de registro agonista se indican en la columna titulada X. Las medidas de respuesta para el agonista de la que parece tener el valor de E _max grande se introducen en la columna A, y los de los agonistas de otros se introducen en las columnas adyacentes letras. Mediciones repetidas de las curvas de concentración-respuesta se introducen en sub-columnas de una determinada columna con letras.
2. Seleccione la hoja de gráfico en el que se representan los datos, y analizar los datos mediante análisis de regresión no lineal utilizandola ecuación de derecho, log (agonista) vs respuesta - pendiente variable (cuatro parámetros). Restringir el "fondo" parámetro a cero, y realizar el análisis de regresión. Copie el "Top" (E _max) y registro CE _{de 50} parámetros en una hoja de cálculo Excel para su uso en el cálculo de las estimaciones de los parámetros iniciales. El agonista con la estimación más grande de E _max es designado como el "agonista estándar", mientras que los agonistas son designados como "agonistas de la prueba".
3. Calcular la estimación inicial de registro τK _obs (LOGR1) como el logaritmo negativo _valor de EC50 de agonista estándar (-log EC ₅₀ ').
   
   Calcular la estimación inicial de la RA registro _i valor de cada agonista de prueba (Logra) como log {(Top CE * ₅₀ ') / (Top' * EC _50)}, en el que los parámetros del agonista estándar se indican con un apóstrofo .
   
   Calcular el registro de afinidad Constants de los agonistas de la prueba (LOGK2 - LOGK5) como el logaritmo negativo de sus respectivos _valores de EC50.

3. La estimación de los valores agonista RAi utilizando análisis de regresión no lineal: no hay actividad constitutiva

1. Introducir los datos en una tabla de datos en el prisma como se describió anteriormente en el punto 2.1. Asegúrese de que los datos para el agonista estándar se introducen en la columna A.
2. Introduzca una ecuación definida por el usuario, "log Rai", en Prisma en varias líneas, como se muestra para el caso que involucra a un total de cinco agonistas:
   • <A> P = LOGK1
   • <A> Q = LOGR
   • <~ A> = Q + Logra LOGR
   • <B> P = LOGK2
   • <C> P = LOGK3
   • <D> P = LOGK4
   • <E> P = LOGK5
   • Y = MSys / (1 + {[(1 +10 ^ (X + P)) / (10 ^ (X + Q))] ^ M})
3. Introduzca las estimaciones iniciales de los parámetros de la siguiente manera:
   Introduzca un valor arbitrariamente baja de 0 en el registro constante de afinidad (LOGK1) del agonista estándar.
   
   Entrar en la estimación inicial deLOGR y las constantes de afinidad (LOGK2 - LOGK5) y registro de valores RAi (Logra) de los agonistas de la prueba.
   
   Asignar el presupuesto inicial del factor de pendiente del transductor (M) un valor de 1,0.
   
   Asignar la estimación inicial de la respuesta máxima del sistema (MSys) un valor equivalente al _máximo E del agonista estándar (Top).
4. Aplican las restricciones siguientes parámetros: LOGK1 obligado a la constante, 0; LOGR1, MSys y M, valor compartido para todos los conjuntos de datos; LOGK2 - LOGK5 y Logra, sin restricciones.
5. Iniciar el análisis de regresión no lineal. Los resultados de rendimiento del log K _obs y registro RA _i los valores de los agonistas de la prueba. Si el agonista de la norma es un agonista completo, entonces el tanto en el log K _obs y registro de valores de RA _i son exactas. Si el agonista más eficaz (agonista estándar) es en realidad un agonista parcial, el K _obs valores de los más eficaces agonists puede ser sobreestimado. Sin embargo, las estimaciones de registro RA _i todavía precisa en esta situación.
6. Si la regresión no converge, el experimentador puede desear para trazar la curva teórica definida por los parámetros estimados iniciales. Si hay grandes desviaciones entre los puntos de datos y las curvas teóricas, revisar el cálculo de las estimaciones de los parámetros iniciales. Si uno o más agonistas han _Emax los valores equivalentes a la del agonista de la norma, puede ser necesario limitar su log K _obs valores a 0 para la regresión a converger en una solución.

4. La medición de agonista curvas concentración-respuesta en ensayos basados ​​en células que exhiben actividad constitutiva del receptor

1. Para la estimación de los agonistas K valores de _b en unidades absolutas de ^M-1, basado en células en ensayos in vitro se utilizan muestran que la actividad constitutiva del receptor. Constituciónla actividad del receptor TIV se define como el aumento de la respuesta por encima del nivel basal causada por la expresión del receptor de interés.
2. Elija agonistas y el diseño del experimento se describe en la sección 1.2.
3. Para cada curva concentración-respuesta, medir la respuesta ante la ausencia de agonistas en células no transfectadas (respuesta basal) y en las células transfectadas con el receptor de interés (respuesta basal + respuesta constitutiva). Medir la respuesta en la presencia de diferentes concentraciones de los distintos agonistas como se describe en la Sección 1.3.
4. Calcular la actividad del receptor constitutiva y la respuesta a cada concentración de agonista como la respuesta medido menos la respuesta basal en las células no transfectadas con el receptor. La figura 6 muestra las respuestas a diversos agonistas calculado de esta manera por una vía de señalización que exhiben actividad constitutiva muy bajo.

5. Preliminar de unalysis agonista de curvas concentración-respuesta exhibe la actividad constitutiva

1. Introduzca los datos (por ejemplo, la Figura 6) en una tabla de datos en el prisma como se describe en la sección 3.1, pero también entran en la respuesta causada por la actividad del receptor constitutiva en las columnas correspondientes letras que corresponde a una concentración de agonista registro de -20. Un logaritmo negativo grande se entra a la aproximación de una concentración de agonista de cero.
2. Analizar los datos como se describe anteriormente en la sección 2.2, pero con el "fondo" de parámetros limitados por lo que es "común para todos los conjuntos de datos." Copie el "Top" (E _max), compartida "Abajo" y registro de parámetros de EC50 en una hoja de cálculo Excel para su uso en el cálculo de las estimaciones de los parámetros iniciales.
3. Calcular las estimaciones iniciales de los parámetros de la siguiente manera:
   
   La afinidad de registro constante de los agonistas estándar (LOGK1) o cualquier otro agonista total, la prueba debe ser determinado en experimentos separados como se describió anteriormente ³
   Calcular la estimación inicial del log K _obs valor de cada prueba agonista parcial (es decir, sólo LOGK2 en este caso) como log {(Top'-Top) / (CE ₅₀ (Top'-Bottom))}, en el que "Bottom "denota la respuesta causada por la activación del receptor constitutiva.
   
   Calcular la estimación inicial de log K _b (LOGKb) para cada agonista como log {Inicio / (EC ₅₀ inferior)}.
   
   Calcular la estimación inicial de registro de _sistema τ (LOGTsys) como log {inferior / (Top '- inferior)}.

6. Estimación de los valores Kb agonista de respuestas presentan una actividad constitutiva del receptor mediante el análisis de regresión no lineal

1. Introducir los datos en una tabla de datos en el prisma como se describió anteriormente en el punto 3.1
2. Introduzca una ecuación definida por el usuario, "Registro de Kb", en Prisma en varias líneas, como se muestra por la condición de dos agonistas:
   • <A> LOGKOBS = LOGK1
   • <B> LOGKOBS = LOGK2
   • A = (10 ^ (X + LOGKOBS)) +1
   • B = 10 ^ (X + + LOGTSYS LOGKB)
   • C = (10 ^ (LOGTSYS))
   • Y = MSys / {1 + [(A / (B + C)) ^ M]}
3. Introduzca las estimaciones iniciales de los parámetros de la siguiente manera:
   
   Introduzca las constantes de afinidad de cada agonista (LOGK1 - introduzca un valor determinado en el paso 5.3).
   
   Entrar en el K _obs estimaciones de cada agonista de prueba.
   
   Introduzca las estimaciones Kb de los agonistas.
   
   Escriba log τ _sistema (LOGTsys) estiman.
   
   Asignar el factor de la pendiente del transductor (M) y la respuesta máxima del sistema (MSys) los valores de 1,0 y 'Top (E _max de los agonistas de serie), respectivamente.
4. Aplican las restricciones siguientes parámetros: LOGTsys, MSys y M, valor compartido para todos los conjuntos de datos; LOGK2 y LOGKb, sin restricciones.
5. Iniciar el análisis de regresión no lineal. Los resultados de rendimiento en el registro de K _b del agonista estándar, el log K _obs K _b de los agonistas parciales, y la respuesta máxima del sistema (MSys), el valor de τ _sistema para el complejo receptor libre (LOGTsys), y el factor de la pendiente del transductor en el modelo de operación (M).
6. Si la regresión no converge, siga los pasos descritos anteriormente en el punto 3.6.

7. Resultados representante

La Figura 5 muestra algunos de los datos previamente publicados en la hidrólisis de fosfoinosítidos inducida por agonistas muscarínicos en células ováricas de hámster chino que expresan establemente el receptor muscarínico M ₃ ^12. Las curvas de concentración-respuesta de algunos agonistas muscarínicos fueron medidos en este ensayo. Los datos fueron analizados como se describe arriba en la Sección 3 para estimar el valor de K _b de cada agonista, expresó en relación a la de oxotremorina-M. Estas estimaciones registro RA _i son, carbacol, -0,56 ± 0,063; Arecolínea, -0,60 ± 0,074; pilocarpina, -1,20 ± 0,15, y MCN-343-A, -1,92 ± 0,31. Las curvas teóricas representan el ajuste de mínimos cuadrados de la ecuación de regresión para los datos (sección 3.2). Las estimaciones correspondientes de la respuesta máxima del sistema _(sistema M) y el factor de la pendiente del transductor (M) fueron 53,9 ± 1,3 y 1,15 ± 0,09, respectivamente. El registro de K _obs valores de los agonistas, excepto la de oxotremorina-M, carbacol, 5,19 ± 0,14; arecolina, 5,49 ± 0,12; pilocarpina, 5,58 ± 0,16 y MCN-343-A, 5,27 ± 0,33.

La figura 6 muestra los resultados de los experimentos sobre la hidrólisis agonista muscarínico estimulada phosphoinositide en células HEK 293 que expresan establemente G _α15 ^3. La expresión transitoria de la M ₃ receptores muscarínicos provocado un aumento en la hidrólisis de fosfoinosítidos basal, que se atribuyó al receptor constitutiva actividaddad. Los datos fueron analizados para estimar el registro de valores de K _b de oxotremorina-M y el MCN-343-A como se describe en la Sección 6. Este análisis arrojó valores de log K _b de 8,30 ± 0,59 y 6,59 ± 0,77 para oxotremorina-M y el MCN-343-A, respectivamente. Las curvas teóricas representan el ajuste de mínimos cuadrados de la ecuación de regresión para los datos (ver sección 6.2). Las estimaciones de log τ _sistemas, los _sistemas M y M fueron -2,29 ± 0,59, 95,8 ± 2,8 y 0,72 ± 0,08, respectivamente. La estimación del valor de K _obs MCN-A-343 fue de 5,35 ± 0,46.

Figura 1. Relación entre la actividad de la actividad del receptor individual y el nivel medio de la activación de la población receptora. Receptor único, el comportamiento teórico de un solo receptor sometidos Transitions entre activo (On) e inactivo (Off) indica la presencia de un agonista se muestra. Las constantes de afinidad de los agonistas de los estados activos e inactivos se indican con K _{b y} K, respectivamente. Comportamiento de la población, el comportamiento teórico de los receptores de varios procesos de transición al azar entre los estados activos e inactivos en presencia de un agonista se muestra. Población promedio, el nivel medio de la activación del receptor en una población de receptores en la presencia de una concentración específica del agonista de la muestra. El nivel de activación de la población receptora que se conoce como el estímulo.

Figura 2. Relación entre la función de activación de los receptores y la eficacia (ε) y la constante de afinidad observada (K _obs) de la media de agonista. Población, el nivel promedio deactivación de los receptores provocada por las crecientes concentraciones de agonista se muestra. La activación del receptor, el nivel medio de activación de los receptores se traza agonista de la concentración del agonista de la sesión. La concentración logaritmo negativo de agonista necesaria para la activación del receptor de media máxima es equivalente a la afinidad de registro observado constante del agonista (log K _obs). El máximo de la función de activación de los receptores se denota como la eficacia (ε).

Figura 3. Ejemplos de curvas concentración-respuesta para la estimulación de la ^[3H] acumulación inositolfosfato por varios agonistas muscarínicos en células ováricas de hámster chino que expresa el ser humano M ₃ de los receptores muscarínicos. Un total de nueve agonista curvas concentración-respuesta se midieron. El experimento se puede dividir en dos partes. Para cada parte, el agonista de la norma (oxotremorineM) siempre se prueba con agonistas adicionales. De este modo, dos experimentos del tipo mostrado en A y B son necesarias para medir las curvas de concentración-respuesta de los agonistas de nueve si sólo cinco agonistas se puede probar a la vez. Los datos son de Ehlert et al. ^12.

Figura 4. Ejemplos de curvas concentración-respuesta para la estimulación de ^[3H] acumulación inositolfosfato por varios agonistas muscarínicos en las células HEK 293 que expresan el receptor del M ₂ muscarínico y G _α15. Expresión de los receptores M ₂ causó un 30 - 35% ^[3 H] Respuesta inositolfosfato, que se atribuyó a la actividad del receptor constitutiva. Los datos son de Ehlert et al. ^12.

Figura 5. 3 de los receptores muscarínicos. Las curvas de concentración-respuesta de algunos agonistas muscarínicos para la hidrólisis de fosfoinosítidos estimulante se muestran. Los valores medios de tres experimentos ± SEM se muestran. Los datos son de Ehlert et al. ^12.

Figura 6. Oxotremorina-M-y MCN-A-343-hidrólisis mediada phosphoinositide en células HEK 293 que expresan G _α15 y el receptor muscarínico M _3. Hidrólisis de fosfoinosítidos se expresa en relación al _máximo de E oxotremorina-M. En ausencia del agonista, la hidrólisis de fosfoinosítidos atribuye a la expresión del receptor M ₃ representaron aproximadamente el 2% de la respuesta. Las medias de tres experimentos ± SEM se muestran. El dATA son de Ehlert et al. ^3.

Discussion

Debido a que nuestro método de estimación de la AR _I (relativo valor de K _b) sólo se requiere la medición de los agonistas de curvas concentración-respuesta, nuestro análisis se puede hacer en cualquier momento estas curvas se miden.

Si el día a día, la variación en la respuesta de la preparación experimental (por ejemplo, las células o tejido) es grande, las medidas de respuesta de cada curva concentración-respuesta puede ser normalizada con respecto a los "Top" estimación del agonista estándar para cada día experimento. Una estimación de Inicio y registro CE ₅₀ se calcula para cada repetición de la concentración de la curva de respuesta agonista estándar mediante análisis de regresión descrito en los puntos 2 y 5. Los valores de respuesta de todos los agonistas de curvas concentración-respuesta en un día determinado se normalizan respecto a la estimación superior del agonista estándar para ese día. Estos datos normalizados se analizan como se describió anteriormente Beginnción en la Sección 3.

La precisión de la estimación de K _b depende de una estimación precisa de la actividad del receptor constitutiva. En nuestro caso, la transfección de la M ₃ receptores en células HEK 293 provocó un aumento en la hidrólisis de fosfoinosítidos que oscilaban entre 500 - 1.000 cpm de ^[3H] inositolphosphates mide en la presencia de litio en las células pre-marcadas con [3H] inositol . La respuesta máxima al carbacol fue de aproximadamente 50.000 - 60.000 cpm. Tenía la respuesta constitutiva sido mayor y menos variable, nuestra estimación de los valores de K _b de la oxotremorina-M y el MCN-343-A habría sido más exacto. La estimación de K _b también depende de tener una estimación precisa del factor de la pendiente del transductor (M) en el modelo operativo. En consecuencia, una mayor precisión se podría haber logrado si las concentraciones de agonista estaban más espaciadas según se recomienda en la sección 1.3. Running agonistas adicionales en el experimento también aumenta en gran medida la precisión de la estimación de M, y por lo tanto, de K _b.

Si hay diferentes estados activos de los receptores de la señal a través de proteínas de acoplamiento diferentes (por ejemplo, las proteínas G), entonces nuestro método de análisis proporciona una estimación precisa de los agonistas _b K y RA _i los valores para cada vía efectora ^3,6. Si más de un estado activo contribuye a una respuesta única medida, nuestro método de estimación de la AR _I y K _b representa un promedio ponderado de los diferentes estados activos en función de su abundancia relativa y la actividad ^3.

La actividad del receptor constitutivo puede ser inducida por la sobreexpresión de la Revolución Cultural y su complementario de proteínas G ^13. Esto puede cambiar la afinidad observada y la eficacia del complejo agonista-receptor, y puede causar que no pseñalización hysiological. Pero los cambios en la naturaleza de la respuesta y la afinidad observada y la eficacia de la población receptora no implican cambios en los estados cuánticos fundamentales del receptor, sólo un cambio en su número y la probabilidad de isomerización. Así, las proteínas G no son tanto un factor determinante de los efectos de las drogas tanto como una ventana a diferentes efectores selectivo de los receptores de los estados. Si nuestro método de análisis se aplica a los ensayos de GPCR específicas de señalización que involucra un efector único (por ejemplo, la proteína G), debería ser posible medir agonista valores de K _b para efector selectivo de los receptores de los estados - la última medida del sesgo de agonista.