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Biology

जी प्रोटीन युग्मित रिसेप्टर्स पर agonist गतिविधि को बढ़ाता

doi: 10.3791/3179 Published: December 26, 2011

Summary

आत्मीयता सक्रिय राज्य के लिए एक agonist के निरंतर आकलन के लिए एक विधि (

Protocol

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1. एकाग्रता प्रतिक्रिया agonist घटता के मापन: नहीं विधान गतिविधि

  1. रिश्तेदार agonist कश्मीर मूल्यों के आकलन (आरए मैं) के लिए, कम से कम दो agonist एकाग्रता प्रतिक्रिया घटता की एक श्रृंखला की आवश्यकता है. GPCR के कार्यात्मक प्रतिक्रिया के लिए इन विट्रो परख में कोई प्रदान मापा जा सकता है कि agonist की एकाग्रता और रिसेप्टर mediates के एक ही प्रकार की प्रतिक्रिया से नियंत्रित किया जा सकता है. उपयुक्त सेल आधारित assays 4,7 शिविर का माप और एक सेल लाइन में inositolphosphate संचय 8,9 एक रीकॉम्बीनैंट रिसेप्टर व्यक्त शामिल हैं. पूरे ऊतक assays के उदाहरण 10 चिकनी मांसपेशियों या 2 एम muscarinic रिसेप्टर और क्षेत्र उत्तेजित 11 आलिंद छोड़ दिया चूहे के संकुचन में β 1-adrenoceptor की मध्यस्थता परिवर्तन का संकुचन के माप शामिल हैं.
  2. एक अत्यधिक प्रभावशाली agonist सहित agonists के विश्लेषण के लिए एक श्रृंखला चुनें(उदाहरण के लिए, अंतर्जात ligand). किसी भी प्रयोग में, प्रत्येक agonist के लिए पूर्ण एकाग्रता प्रतिक्रिया घटता उपाय. यदि agonists की संख्या भी बड़ी है एक ही प्रयोग में परख पूरा उपसमूहों, प्रत्येक एक ही प्रयोग के लिए agonists के एक प्रबंधनीय संख्या के निर्वाचकगण में agonists विभाजित. प्रत्येक उपसमूह के लिए, एकाग्रता प्रतिक्रिया अत्यधिक प्रभावशाली agonist की वक्र के साथ मापने के उपसमूह में अन्य agonists के उन लोगों के साथ (चित्र 3 देखें). लगभग 6 बार डेटा की परिवर्तनशीलता के आधार पर प्रत्येक 3 उपसमूह के लिए प्रयोग दोहराएँ.
  3. प्रत्येक एकाग्रता प्रतिक्रिया वक्र के लिए, agonist (बेसल प्रतिक्रिया) के अभाव में प्रतिक्रिया को मापने, और agonist की बढ़ती सांद्रता की उपस्थिति में. अंतरिक्ष agonist एक लॉग पैमाने लगभग 0.3 हर पर समान सांद्रता - 0.7 लॉग 10 इकाइयों, प्रतिक्रियाओं की रेंज को कवर और अधिक से अधिक (ई अधिकतम) प्रतिक्रिया (चित्रा 3 देखें) को परिभाषित . Experim के लिएसेल लाइनों पर पिता, प्रत्येक माप तीन प्रतियों में किया जाता है.
  4. Agonist के प्रत्येक एकाग्रता की उपस्थिति में मापा से बेसल प्रतिक्रिया घटाएँ. चित्रा 3 में प्लॉट किए जाते प्रतिक्रियाएं इस तरीके से गणना की गई.

2. एकाग्रता प्रतिक्रिया agonist घटता के प्रारंभिक विश्लेषण: नहीं विधान गतिविधि

  1. एकाग्रता प्रतिक्रिया प्रयोगों (उदाहरण के लिए, चित्रा 5) से चश्मे में एक डेटा तालिका में डेटा दर्ज करें. लॉग agonist सांद्रता के सभी एक्स लेबल स्तंभ के तहत प्रवेश कर रहे हैं agonist है कि सबसे बड़ी अधिकतम मूल्य है प्रकट होता है है के लिए प्रतिक्रिया माप एक स्तंभ में प्रवेश कर रहे हैं, और अन्य agonist के लिए उन सन्निकट स्तंभों की लिखित में प्रवेश कर रहे हैं. एक एकाग्रता प्रतिक्रिया घटता दोहराएँ माप किसी दिए गए लिखित स्तंभ का उप - स्तंभों में प्रवेश कर रहे हैं.
  2. ग्राफ पत्रक का चयन करें जिस पर डेटा प्लॉट किए जाते हैं, और nonlinear प्रतीपगमन विश्लेषण का उपयोग करके डेटा का विश्लेषणसमीकरण हकदार, (agonist) लॉग प्रतिक्रिया - चर ढलान (चार मापदंडों) बनाम. विवश शून्य करने के लिए "नीचे" पैरामीटर, और प्रतीपगमन विश्लेषण प्रदर्शन. "शीर्ष" (ई अधिकतम) कॉपी और प्रारंभिक पैरामीटर अनुमान की गणना में इस्तेमाल के लिए एक एक्सेल स्प्रेडशीट में चुनाव आयोग 50 पैरामीटर लॉग इन करें . सबसे बड़ा अधिकतम अनुमान के साथ agonist "मानक agonist" के रूप में नामित है, जबकि अन्य agonists "परीक्षण agonists" के रूप में नामित कर रहे हैं.
  3. लॉग τK के प्रारंभिक OBS नकारात्मक मानक agonist (- लॉग चुनाव आयोग 50 ') के लॉग चुनाव आयोग 50 मूल्य के रूप में (LOGR1) अनुमान की गणना.

    लॉग के रूप में लॉग इन करें मैं प्रत्येक परीक्षा agonist के मूल्य आरए (LOGRA) के प्रारंभिक अनुमान की गणना {(* 50 ईसी) / (शीर्ष * 50 ईसी)} है, जो मानक agonist के मापदंडों में एक apostrophe के साथ चिह्नित हैं .

    लॉग आत्मीयता चुनाव परिकलितउनके संबंधित चुनाव आयोग 50 मूल्यों की नकारात्मक रूप में लॉग - परीक्षण agonists के stants (LOGK5 LOGK2).

3. Agonist राय nonlinear प्रतीपगमन विश्लेषण का उपयोग मूल्यों का आकलन नहीं विधान गतिविधि

  1. चश्मे में एक डेटा तालिका में डेटा दर्ज करें के रूप में 2.1 के अंतर्गत ऊपर वर्णित है. यकीन है कि मानक agonist के लिए डेटा स्तंभ ए में प्रवेश कर रहे हैं
  2. राय लॉग "उपयोगकर्ता परिभाषित समीकरण दर्ज करें, चश्मे में कई लाइनों पर के रूप में मामले के लिए पांच agonists के कुल शामिल दिखाया गया है:
    • <a> पी = LOGK1
    • <a> क्यू = LOGR
    • <~ एक> क्यू = LOGR + LOGRA
    • <B> पी = LOGK2
    • <C> पी = LOGK3
    • <D> पी = LOGK4
    • <E> पी = LOGK5
    • वाई = MSYS / (1 + {[(10 1 ^ (एक्स + पी)) / (10 ^ (एक्स + Q))] ^ M})
  3. के रूप में प्रारंभिक पैरामीटर अनुमान दर्ज करें:
    मानक agonist लॉग आत्मीयता स्थिरांक (LOGK1) के लिए एक 0 के मनमाने ढंग से कम मूल्य दर्ज करें.

    के प्रारंभिक अनुमान दर्ज करेंLOGR और आत्मीयता स्थिरांक (LOGK2 - LOGK5) और लॉग इन परीक्षण agonists के राय मूल्यों (LOGRA).

    Transducer ढलान कारक (एम) 1.0 का एक मूल्य के प्रारंभिक अनुमान निरुपित.

    प्रणाली की अधिक से अधिक प्रतिक्रिया (MSYS) एक ई मानक agonist (शीर्ष) के अधिकतम करने के लिए बराबर मूल्य के लिए प्रारंभिक अनुमान निरुपित.
  4. , MSYS LOGR1, और एम, सभी डेटा सेट के लिए साझा मूल्य; - LOGK5 और LOGRA, नहीं बाधाओं LOGK2 LOGK1 निरंतर 0, के लिए विवश: निम्न पैरामीटर बाधाओं लागू करें.
  5. Nonlinear प्रतीपगमन विश्लेषण का आरंभ करें. परिणाम लॉग कश्मीर उपज OBS और लॉग आरए मैं परीक्षण agonists के मूल्यों. यदि मानक agonist एक पूर्ण agonist है, तो दोनों लॉग कश्मीर OBS और लॉग मूल्यों आरए मैं सही कर रहे हैं. यदि सबसे प्रभावशाली agonist (मानक agonist) वास्तव में एक आंशिक agonist है, तो कश्मीर OBS अधिक प्रभावोत्पादक एजी के मूल्योंonists overestimated हो सकता है. बहरहाल, मैं लॉग आरए के अनुमान अभी भी इस स्थिति में सही कर रहे हैं .
  6. यदि प्रतिगमन एकाग्र नहीं करता है, experimenter प्रारंभिक पैरामीटर अनुमान से परिभाषित करने के लिए सैद्धांतिक वक्र प्लॉट करना चाहते हो सकता है. यदि डेटा अंक और सैद्धांतिक घटता के बीच बड़े विचलन कर रहे हैं, तो प्रारंभिक पैरामीटर अनुमान की गणना की जाँच करें. यदि एक या एक से अधिक agonists अधिकतम मानक agonist के बराबर मूल्यों, यह करने के लिए अपने लॉग कश्मीर OBS प्रतिगमन के लिए 0 से मान एक समाधान पर एकाग्र करने के लिए विवश करने के लिए आवश्यक हो सकता है.

4. एकाग्रता प्रतिक्रिया agonist घटता के मापन सेल आधारित assays में विधान रिसेप्टर गतिविधि प्रदर्शन

  1. Agonist कश्मीर मूल्यों के एम -1, सेल आधारित इन विट्रो assays में उपयोग किया जाता है कि एक्ज़िबिट विधान रिसेप्टर गतिविधि के निरपेक्ष इकाइयों में अनुमान के लिए. संविधानेश्य रिसेप्टर गतिविधि बेसल ब्याज की रिसेप्टर की अभिव्यक्ति की वजह से स्तर से ऊपर प्रतिक्रिया में वृद्धि के रूप में परिभाषित किया गया है.
  2. Agonists चुनें और प्रयोग के रूप में 1.2 अनुभाग में ऊपर वर्णित डिजाइन.
  3. प्रत्येक एकाग्रता प्रतिक्रिया वक्र के लिए, गैर ट्रांसफ़ेक्ट कोशिकाओं में agonist के अभाव (बेसल प्रतिक्रिया) और ब्याज की रिसेप्टर (बेसल प्रतिक्रिया + विधान प्रतिक्रिया) के साथ ट्रांसफ़ेक्ट कोशिकाओं में प्रतिक्रिया उपाय. विभिन्न agonists के रूप में धारा 1.3 में ऊपर वर्णित के विभिन्न सांद्रता की उपस्थिति में प्रतिक्रिया उपाय.
  4. विधान रिसेप्टर गतिविधि और मापा प्रतिक्रिया रिसेप्टर के साथ नहीं ट्रांसफ़ेक्ट कोशिकाओं में बेसल प्रतिक्रिया ऋण के रूप में agonist के प्रत्येक एकाग्रता के जवाब की गणना. चित्रा 6 विभिन्न agonists एक संकेतन मार्ग का प्रदर्शन बहुत कम रचनात्मक गतिविधि के लिए इस तरीके से गणना करने के लिए प्रतिक्रियाओं से पता चलता है.

5. प्रारंभिक एकएकाग्रता प्रतिक्रिया agonist घटता के alysis विधान गतिविधि प्रदर्शन

  1. एक डेटा तालिका में (उदाहरण के लिए, चित्रा 6) चश्मे में डेटा के रूप में धारा 3.1 में वर्णित है, लेकिन यह भी उचित लिखित -20 के एक लॉग agonist एकाग्रता इसी कॉलम में विधान रिसेप्टर गतिविधि की वजह से प्रतिक्रिया दर्ज करें में दर्ज करें. शून्य के लगभग एक agonist एकाग्रता के लिए एक बड़ी नकारात्मक लघुगणक दर्ज किया गया है.
  2. डेटा के रूप में खंड 2.2 में ऊपर वर्णित है, लेकिन साथ "नीचे" पैरामीटर इतना विवश कि यह विश्लेषण "सभी डेटा सेट के लिए साझा." "शीर्ष" (ई अधिकतम), साझा "नीचे" कॉपी और प्रारंभिक पैरामीटर अनुमान की गणना में इस्तेमाल के लिए एक एक्सेल स्प्रेडशीट में EC50 मापदंडों लॉग इन करें .
  3. के रूप में प्रारंभिक पैरामीटर अनुमान की गणना:

    लॉग निरंतर आत्मीयता मानक (LOGK1) agonist या किसी भी पूरी परीक्षण agonist के अलग - अलग प्रयोगों में निर्धारित किया जाना चाहिए के रूप में 3 पहले वर्णित
    लॉग इन के प्रारंभिक अनुमान की गणना कश्मीर OBS प्रत्येक आंशिक परीक्षण agonist की लॉग {(Top' टॉप) / (ईसी 50 (Top' नीचे))} के रूप में (यानी, केवल इस मामले में LOGK2) मूल्य, जो "नीचे में "विधान रिसेप्टर सक्रियण द्वारा कारण प्रतिक्रिया अर्थ.

    लॉग के रूप में प्रत्येक agonist के लिए लॉग कश्मीर ख (LOGKb) के प्रारंभिक अनुमान की गणना {/ शीर्ष (ईसी 50 नीचे) }.

    लॉग के रूप में लॉग τ व्यवस्था (LOGTsys) के प्रारंभिक अनुमान की गणना {/ नीचे (शीर्ष - नीचे )}.

6. Agonist Kb मूल्यों के विधान रिसेप्टर गतिविधि nonlinear प्रतीपगमन विश्लेषण का उपयोग कर प्रदर्शन प्रतिक्रियाओं के लिए आकलन

  1. चश्मे में एक डेटा तालिका में डेटा दर्ज करें के रूप में 3.1 के अंतर्गत ऊपर वर्णित
  2. Kb प्रवेश करें "उपयोगकर्ता परिभाषित समीकरण दर्ज करें, चश्मे में कई लाइनों पर के रूप में दो agonists के हालत के लिए दिखाया गया है:
    • <a> LOGKOBS = LOGK1
    • <B> LOGKOBS = LOGK2
    • एक = (10 ^ (एक्स LOGKOBS +)) 1
    • बी = 10 ^ (एक्स LOGTSYS + + LOGKB)
    • सी = (10 ^ (LOGTSYS))
    • वाई = MSYS / {1 + [(एक / (बी + सी)) ^ M]}
  3. के रूप में प्रारंभिक पैरामीटर अनुमान दर्ज करें:

    प्रत्येक agonist की आत्मीयता स्थिरांक (5.3 कदम के तहत निर्धारित मान दर्ज LOGK1) दर्ज करें.

    कश्मीर दर्ज करें OBS प्रत्येक परीक्षण agonist का अनुमान है .

    Agonists के Kb अनुमान दर्ज करें.

    लॉग इन τ व्यवस्था अनुमान (LOGTsys) दर्ज करें.

    Transducer ढलान कारक (एम) और प्रणाली की अधिक से अधिक प्रतिक्रिया (MSYS) 1.0 और शीर्ष (मानक agonist के ई अधिकतम) के मूल्यों क्रमशः निरुपित.
  4. लागू करें, LOGK2 और LOGKb, नहीं बाधाओं LOGTsys MSYS, और एम, सभी डेटा सेट के लिए साझा मूल्य: निम्नलिखित पैरामीटर की कमी.
  5. Nonlinear प्रतीपगमन विश्लेषण का आरंभ करें. परिणाम मानक agonist के लॉग कश्मीर ख, लॉग कश्मीर OBS उपज कश्मीर आंशिक agonists, और (MSYS) प्रणाली, τ व्यवस्था मूल्य मुक्त रिसेप्टर परिसर (LOGTsys) के लिए, और परिचालन मॉडल (एम) में transducer ढलान कारक की अधिक से अधिक प्रतिक्रिया के मूल्यों.
  6. यदि प्रतिगमन एकाग्र नहीं करता है, 3.6 बिंदु के तहत ऊपर वर्णित चरणों का पालन करें.

7. प्रतिनिधि परिणाम

चित्रा 5 चीनी हम्सटर अंडाशय stably एम 3 12 muscarinic रिसेप्टर व्यक्त कोशिकाओं में muscarinic प्रेरित-agonist phosphoinositide hydrolysis पर हमारे पहले प्रकाशित डेटा के कुछ दिखाता है. चयनित muscarinic agonists के एकाग्रता प्रतिक्रिया घटता इस परख में मापा गया. डेटा के रूप में धारा 3 के तहत ऊपर वर्णित करने के लिए प्रत्येक agonist कश्मीर ख मूल्य का अनुमान है कि oxotremorine - एम के रिश्तेदार व्यक्त विश्लेषण किया गया. इन लॉग आरए मैं अनुमान हैं, carbachol, -0.56 ± 0.063, arecoलाइन, -0.60 ± 0.074; pilocarpine -1.20 ± 0.15, और MCN A-343, -1.92 ± 0.31. सैद्धांतिक घटता फिट प्रतीपगमन समीकरण के डेटा (3.2 धारा) के लिए कम से कम वर्गों का प्रतिनिधित्व करते हैं. प्रणाली की अधिकतम प्रतिक्रिया (एम व्यवस्था) और transducer ढलान कारक (एम) की इसी अनुमान 53.9 ± 1.3 और 1.15 ± 0.09, क्रमशः थे. लॉग OBS agonists के oxotremorine - एम के सिवाय इसके कि मान, कश्मीर, carbachol, 5.19 ± 0.14, arecoline, 5.49 ± 0.12, pilocarpine, 5.58 ± 0.16 और MCN-A-343, 5.27 ± 0.33.

चित्रा 6 muscarinic agonist उत्तेजित stably α15 जी 3 व्यक्त HEK 293 कोशिकाओं में phosphoinositide hydrolysis पर प्रयोगों के परिणामों से पता चलता है. एम 3 muscarinic रिसेप्टर के क्षणिक अभिव्यक्ति बेसल phosphoinositide hydrolysis, जो विधान रिसेप्टर activ के लिए जिम्मेदार ठहराया गया था में वृद्धि का कारणअल्पसंख्यक. oxotremorine एम और MCN-A-343 के लॉग कश्मीर मूल्यों का अनुमान के रूप में धारा 6 के अधीन वर्णित डेटा विश्लेषण किया गया. इस विश्लेषण oxotremorine एम और MCN-A-343 के लिए लॉग कश्मीर के 8.30 ख मूल्यों ± 0.59 और 6.59 ± 0.77 क्रमशः झुकेंगे, . सैद्धांतिक घटता प्रतीपगमन समीकरण के डेटा के लिए कम से कम वर्गों फिट (खंड 6.2 देखें) का प्रतिनिधित्व करते हैं. लॉग τ व्यवस्था, एम व्यवस्था और एम के अनुमान -2.29 ± 95.8 ± 0.59, 2.8 और 0.72 ± 0.08, क्रमशः थे. कश्मीर के अनुमान OBS MCN-A-343 के मूल्य 5.35 ± 0.46 है .

चित्रा 1
1 एकल रिसेप्टर गतिविधि और रिसेप्टर जनसंख्या के सक्रियण के औसत स्तर के बीच संबंध. एकल रिसेप्टर गतिविधि चित्रा, एक एकल transitio के दौर से गुजर रिसेप्टर के सैद्धांतिक व्यवहारसक्रिय एनएस () के बीच और निष्क्रिय (बंद) के एक agonist की उपस्थिति में राज्यों दिखाया गया है. सक्रिय और निष्क्रिय राज्यों के लिए agonist की आत्मीयता स्थिरांक कश्मीर और कश्मीर एक के द्वारा चिह्नित हैं, क्रमशः जनसंख्या व्यवहार, कई सक्रिय और निष्क्रिय राज्यों के बीच एक agonist की उपस्थिति में यादृच्छिक संक्रमण के दौर से गुजर रिसेप्टर्स की सैद्धांतिक व्यवहार जनसंख्या. दिखाया गया है. औसत agonist का एक विशिष्ट एकाग्रता की उपस्थिति में रिसेप्टर्स की आबादी में रिसेप्टर सक्रियण के औसत स्तर से पता चला है. रिसेप्टर की आबादी का सक्रियण स्तर के प्रोत्साहन के रूप में जाना जाता है.

चित्रा 2
चित्रा 2 रिसेप्टर सक्रियण समारोह और प्रभावकारिता (ε) और औसत agonist. जनसंख्या मनाया आत्मीयता स्थिरांक (कश्मीर OBS) के बीच संबंध के औसत स्तररिसेप्टर सक्रियण रिसेप्टर agonist की सांद्रता में वृद्धि दिखाया गया है द्वारा सक्रियण हासिल है. है, रिसेप्टर सक्रियण के औसत स्तर agonist के लॉग एकाग्रता agonist प्लॉट है. agonist के नकारात्मक लॉग एकाग्रता आधा अधिकतम रिसेप्टर सक्रियण के लिए आवश्यक लॉग मनाया agonist (लॉग कश्मीर OBS) के लगातार आत्मीयता के बराबर है. रिसेप्टर सक्रियण समारोह की अधिकतम प्रभावकारिता (ε) के रूप में चिह्नित है.

चित्रा 3
चित्रा 3 [3] एच चीनी हम्सटर अंडाशय मानव एम 3 muscarinic रिसेप्टर व्यक्त की कोशिकाओं में विभिन्न muscarinic agonists द्वारा inositolphosphate संचय की उत्तेजना के लिए एकाग्रता प्रतिक्रिया घटता के उदाहरण. . कुल नौ agonist एकाग्रता प्रतिक्रिया घटता मापा गया. प्रयोग दो भागों में विभाजित किया जा सकता है है. प्रत्येक भाग के लिए, मानक agonist (oxotremorinEM) हमेशा अतिरिक्त agonists के साथ है एक साथ परीक्षण किया. इस प्रकार, दो प्रयोगों में दिखाया गया है प्रकार की एक और नौ agonists के एकाग्रता प्रतिक्रिया घटता उपाय है अगर एक बार में केवल पांच agonists assayed किया जा सकता है है आवश्यक हैं. डेटा Ehlert एट अल से कर रहे हैं 12..

चित्रा 4
चित्रा 4 [3 एच] inositolphosphate संचय की उत्तेजना के लिए एकाग्रता प्रतिक्रिया घटता के HEK 293 मानव 2 एम muscarinic रिसेप्टर और α15 जी व्यक्त कोशिकाओं में विभिन्न muscarinic agonists के द्वारा उदाहरण . 30 एम रिसेप्टर 2 की अभिव्यक्ति एक कारण होता है - 35% [3 एच] inositolphosphate प्रतिक्रिया है, जो विधान रिसेप्टर गतिविधि के लिए जिम्मेदार ठहराया गया था. डेटा Ehlert एट अल से कर रहे हैं 12..

चित्रा 5
चित्रा 5. एम 3 muscarinic रिसेप्टर व्यक्त . उत्तेजक phosphoinositide hydrolysis के लिए चयनित muscarinic agonists के एकाग्रता प्रतिक्रिया घटता दिखाए जाते हैं. तीन प्रयोगों से मूल्यों का मतलब ± SEM दिखाए जाते हैं. डेटा Ehlert एट अल से कर रहे हैं 12..

चित्रा 6
चित्रा 6. Oxotremorine - एम और MCN A-343 की मध्यस्थता HEK 293 α15 जी और एम 3 muscarinic रिसेप्टर व्यक्त कोशिकाओं में phosphoinositide hydrolysis. Phosphoinositide hydrolysis oxotremorine एम अधिकतम रिश्तेदार व्यक्त की है. Agonist के अभाव में, phosphoinositide hydrolysis एम 3 रिसेप्टर प्रतिक्रिया के लगभग 2% के लिए हिसाब की अभिव्यक्ति के लिए जिम्मेदार ठहराया . तीन ± प्रयोगों SEM के साधन दिखाए जाते हैं. घअता Ehlert एट अल से कर रहे हैं 3 ..

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Discussion

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क्योंकि आरए मैं (सापेक्ष कश्मीर मूल्य) का आकलन करने के लिए हमारे विधि केवल एकाग्रता प्रतिक्रिया agonist घटता के माप की आवश्यकता है, हमारे विश्लेषण के किसी भी समय इन घटता मापा जाता है किया जा सकता है.

यदि एक दिन का प्रयोगात्मक तैयारी (जैसे, कोशिकाओं, या ऊतक) के जवाब में भिन्नता बड़ी है, प्रत्येक वक्र एकाग्रता प्रतिक्रिया की प्रतिक्रिया माप "शीर्ष" मानक agonist के लिए अनुमान के सापेक्ष सामान्यीकृत किया जा सकता है प्रत्येक दिन प्रयोग. टॉप और लॉग चुनाव आयोग 50 का अनुमान एकाग्रता प्रतिक्रिया वक्र प्रतिगमन विश्लेषण के रूप में धारा 2 और 5 में वर्णित द्वारा मानक agonist के प्रत्येक को दोहराने के लिए अनुमान है. किसी दिए गए दिन पर agonist एकाग्रता प्रतिक्रिया घटता के सभी की प्रतिक्रिया मानों उस दिन के लिए मानक agonist के शीर्ष अनुमान के सापेक्ष सामान्यीकृत कर रहे हैं. ये सामान्यीकृत डेटा तो beginn के ऊपर वर्णित के रूप में विश्लेषण कर रहे हैंधारा 3 में आईएनजी.

कश्मीर का आकलन की सटीकता विधान रिसेप्टर गतिविधि का एक सटीक आकलन पर निर्भर करता है. हमारे मामले में, HEK 293 कोशिकाओं में एम 3 रिसेप्टर के अभिकर्मक phosphoinositide hydrolysis में वृद्धि के कारण होता है कि के बारे में 500 से लेकर 1,000 [3 एच] कोशिकाओं में लिथियम की उपस्थिति में मापा inositolphosphates सीपीएम पूर्व लेबल के साथ [3H] inositol . carbachol के लिए अधिक से अधिक प्रतिक्रिया लगभग 50,000 - 60,000 सीपीएम. अगर विधान प्रतिक्रिया बड़ा और कम चर गया, कश्मीर के oxotremorine एम और MCN-A-343 मूल्यों के हमारे अनुमान अधिक सटीक होता. कश्मीर का अनुमान भी परिचालन मॉडल में transducer ढलान कारक (एम) के एक सटीक अनुमान होने पर निर्भर करता है. नतीजतन, अधिक सटीकता अगर agonist की सांद्रता और अधिक बारीकी के रूप में 1.3 अनुभाग के तहत सिफारिश की दूरी पर थे किया गया है हासिल सकता है. Runniएनजी प्रयोग में अतिरिक्त agonists भी बहुत एम के अनुमान की सटीकता बढ़ जाती है, और इसलिए कश्मीर ख.

यदि वहाँ रिसेप्टर के विभिन्न सक्रिय कहा गया है कि विभिन्न युग्मन प्रोटीन (जैसे, जी प्रोटीन) के माध्यम से संकेत है, तो हमारे विश्लेषण की विधि agonist कश्मीर ख और आर ए के एक सटीक अनुमान प्रदान करता है मैं प्रत्येक effector 3,6 मार्ग के लिए मूल्यों. यदि एक से अधिक सक्रिय राज्य एक एकल मापा प्रतिक्रिया करने के लिए योगदान देता है, तो आरए मैं और कश्मीर के आकलन के हमारे तरीके अलग सक्रिय उनके रिश्तेदार बहुतायत और 3 गतिविधि के आधार पर राज्यों के एक भारित औसत का प्रतिनिधित्व करता है.

विधान रिसेप्टर गतिविधि GPCR और उसके पूरक जी 13 प्रोटीन व्यक्त अधिक द्वारा प्रेरित किया जा सकता है . यह मनाया आत्मीयता और जटिल agonist - रिसेप्टर की प्रभावकारिता को बदलने और गैर - पी का कारण हो सकता है हो सकता हैhysiological संकेतन. लेकिन प्रतिक्रिया की प्रकृति में परिवर्तन और मनाया और रिसेप्टर जनसंख्या की आत्मीयता प्रभावकारिता रिसेप्टर के मौलिक quantal राज्यों में परिवर्तन, केवल उनकी संख्या में परिवर्तन और isomerization की संभावना का संकेत नहीं है. इस प्रकार, जी प्रोटीन इतना दवा रिसेप्टर के विभिन्न effector चयनात्मक राज्यों पर एक खिड़की के रूप में इतना प्रभाव का एक कारक नहीं हैं. Agonist पूर्वाग्रह का अंतिम उपाय - यदि विश्लेषण के हमारे विधि विशिष्ट GPCR संकेत एक एकल (उदाहरण के लिए, जी प्रोटीन) effector यह रिसेप्टर के effector चयनात्मक राज्यों के लिए agonist कश्मीर मूल्यों को मापने के लिए संभव होना चाहिए शामिल assays के लिए लागू किया जाता है.

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Disclosures

ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.

Acknowledgments

यह काम स्वास्थ्य अनुदान जीएम 69,829 के एक राष्ट्रीय संस्थान द्वारा समर्थित किया गया.

References

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Ehlert, F. J., Suga, H., Griffin, M. T. Quantifying Agonist Activity at G Protein-coupled Receptors. J. Vis. Exp. (58), e3179, doi:10.3791/3179 (2011).More

Ehlert, F. J., Suga, H., Griffin, M. T. Quantifying Agonist Activity at G Protein-coupled Receptors. J. Vis. Exp. (58), e3179, doi:10.3791/3179 (2011).

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