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Biology

Gタンパク質共役受容体でアゴニスト活性を定量化

doi: 10.3791/3179 Published: December 26, 2011

Summary

アクティブ状態のためのアゴニストの親和定数を推定する方法(

Abstract

アゴニストは、Gタンパク質共役受容体(GPCR)の人口をアクティブにすると、それは細胞または組織の応答で絶頂に達するシグナル伝達経路を誘発する。このプロセスは、単一の受容体、受容体の人口、または下流の応答のレベルで分析することができます。ここでは、単一の受容体のアクティブ状態のための一定のアゴニストの親和性の推定値を得るために下流の応答を分析する方法について説明します。

受容体は、アクティブと非アクティブな状態(図1)との間の量子スイッチその代替として動作します。アクティブ状態は、特定のGタンパク質または他のシグナル伝達パートナーと相互作用する。リガンドの非存在下で、非アクティブ状態が優勢。アゴニストの結合は、アクティブな状態(K B)のための定数の親和性が非アクティブ状態(K a)のそれよりもはるかに大きいため、受容体が活性状態に切り替える可能性が高くなります。の総和人口の受容体のすべてのランダムな出力は、時間の受容体の活性化の一定のレベルが得られます。最大値の半分の受容体の活性化を誘発するアゴニストの濃度の逆数は、観察された親和性定数(K OBS)と等価であり、アクティブ状態のアゴニスト受容体複合体の割合は、有効性(ε)(図2)として定義されています。

GPCRの下流応答を分析するための方法は、K OBSとアゴニストの1,2の相対的な有効性の推定を可能にすることが開発されている。このレポートでは、我々は別のアゴニストのように相対的なアゴニストK b値を推定するためにこの分析を変更する方法を示します。恒常的な活性を示すアッセイでは、我々はM -1の絶対的な単位で、K bを推定する方法を示します。

アゴニスト濃度反応曲線3,4を分析する我々の方法が構成されています運用モデル5を使用してグローバルな非線形回帰の。我々は、プリズム(グラフパッドソフトウェア社、サンディエゴ、CA)、ソフトウェアアプリケーションを使用して手順を説明します。分析は、Kの製品OBSと有効性(τ)に比例するパラメータの推定値が得られます。別のそれによって分割された1つのアゴニストのτKOBS、、の推定値は、K bの相対的な尺度(RA i)6です。恒常的な活性を示す任意の受容体の場合は、それは自由な受容体複合体の効果(τSYS)に比例するパラメータを推定することが可能です。このケースでは、アゴニストのK bの値はτSYS 3 / OBSτKと同等です。

私たちの方法は、受容体サブタイプのアゴニストの選択性を決定するための、異なるGタンパク質を介してアゴニスト受容体のシグナル伝達を定量化するのに便利です。

Protocol

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1。アゴニスト濃度反応曲線の測定:ない恒常的な活性

  1. 相対的なアゴニストK b(RA i)の推定には、少なくとも二つのアゴニスト濃度反応曲線のシリーズが必要です。 GPCRの機能的応答のためのインビトロアッセイはいずれもアゴニストの濃度を制御し、受容体を媒介する単一の種類の応答できることを提供する測定することができます。適切なセルベースアッセイは、組換え受容体を発現する細胞株におけるcAMP 4,7の測定とinositolphosphate蓄積8,9などあります。全組織のアッセイの例としては、平滑筋10またはM 2ムスカリン受容体とアトリウム11を左フィールド刺激によるラットの収縮におけるβ1アドレナリン受容体を介した変化の収縮の測定が含まれています。
  2. 非常に有効アゴニストを含む、分析のためのアゴニストのシリーズを選択してください(例えば、内因性リガンド)。与えられた実験では、各アゴニストのための完全な濃度 - 応答曲線を測定する。アゴニストの数は、単一の実験で分析を完了するには大きすぎる場合、サブグループ、単一の実験のためのアゴニストの管理可能な数から成るそれぞれにアゴニストを分ける。各サブグループの場合は、(図3参照)サブグループ内の他のアゴニストのものと一緒に非常に有効アゴニストの濃度 - 応答曲線を測定する。データの変動に応じて、およそ、6回 - 各サブグループ3の実験を繰り返します。
  3. それぞれの濃度反応曲線の場合は、アゴニストの非存在下(基底応答)で、とアゴニストの増加濃度の存在下で反応を測定する。空間一様に対数スケール上でアゴニストの濃度はおよそ0.3から0.7ログ10単位、応答の範囲をカバーし、最大反応(E max)を定義する(図3参照)。 experim用細胞株でents、各測定は三連で行われます。
  4. アゴニストの各濃度の存在下で測定されたものから基礎の応答を引く。図3にプロットされた応答は、この方法で算出した。

2。アゴニスト濃度反応曲線の予備的分析:ない恒常的な活性

  1. プリズム内のデータテーブルへの濃度 - 反応の実験(例えば、図5)からデータを入力してください。ログのアゴニスト濃度のすべてがXというラベルの付いた列の下に入力されている最大のEの最大値を持っているように見えるアゴニストに対する応答の測定は、カラムに入力されている、と他のアゴニストのものは、隣接するには、文字列に入力されます。濃度 - 応答曲線の測定を複製する特定の文字で表される列のサブ列に入力されます。
  2. データがプロットされているグラフシートを選択し、使用して非線形回帰分析によってデータを分析する方程式と題する、ログ(アゴニスト)対応答 - 可変スロープ(4変数)。ゼロに" "パラメータを制約し、回帰分析を行う。 " トップ"(E max)をコピーし、初期パラメータ推定値の計算に使用するためのExcelスプレッドシートにEC 50のパラメータを記録します。他のアゴニストは、"テストのアゴニスト"として指定されているのに対し、最大のEの最大の推定値とアゴニストは、"標準的なアゴニスト"として指定されています。
  3. 標準的なアゴニストの負の対数EC 50値として(LOGR1)OBSログτKの初期推定値を計算する(- logを"EC 50)。

    ログとしてログRA各テストのアゴニストのiの値(LOGRA)の初期推定値を計算する{(トップ* EC 50')/(トップ'* EC 50)}標準アゴニストのパラメータは、アポストロフィで示されている、 。

    ログ親和CONを計算するそれぞれのEC 50値の負の対数として-テストのアゴニストのstants(LOGK5 LOGK2)。

3。非線形回帰分析を用いてアゴニストRAI値の推定:ない恒常的な活性

  1. 2.1の下で上記のようなプリズムでデータテーブルにデータを入力してください。標準的なアゴニストのデータが列Aに入力されていることを確認してください
  2. fiveアゴニストの合計を含む場合のために示すように、ユーザー定義の数式を入力して、複数行でプリズムに、"RAIをログに記録":
    • <A> P = LOGK1
    • <A> Q = LOGR
    • <〜A> Q = LOGR + LOGRA
    • <B> P = LOGK2
    • <C> P = LOGK3
    • <D> P = LOGK4
    • <E> P = LOGK5
    • Y = MSYSの/(1 + {[(1 +10 ^(X + P))/(10 ^(X + Q))] ^ M})
  3. 次のように、初期パラメータ推定値を入力します。
    標準的なアゴニストのログの親和性定数(LOGK1)の場合は0の任意の低い値を入力します。

    の初期推定値を入力します。LOGRとの親和性定数(LOGK2 - LOGK5)とテストのアゴニストのRAI値(LOGRA)を記録します。

    トランスデューサのスロープファクター(M)1.0の値の初期推定値を割り当てます。

    システムの最大応答(MSYSの)標準的なアゴニスト(トップ") のE maxに相当する値の初期推定値を割り当てます。
  4. ; LOGR1、MSYSとM、すべてのデータセットのための共有値、 - LOGK5とLOGRA、制約のないLOGK2 LOGK1定数、0に制約:次のパラメータの制約を適用します。
  5. 非線形回帰分析を開始する。結果は、OBSログKが得られると、テストのアゴニストのRA i値を記録します。標準的なアゴニストはフルアゴニストである場合は、両方のログK OBSとログRA iの値は正確です。最も効果的なアゴニスト(標準アゴニスト)が実際に部分的なアゴニストである場合、より効果AGの後、K OBSの値onistsは過大評価されることがあります。それにもかかわらず、ログRAの推定値は、 私はこのような状況で、まだ正確です。
  6. 回帰が収束しない場合、実験者は、初期のパラメータ推定値によって定義される理論曲線をプロットすることもできます。データ点と理論曲線との間に大きな偏差がある場合は、初期パラメータ推定値の計算を確認してください。つまたは複数のアゴニストは、標準的なアゴニストと同等のE maxの値を持っている場合、それはソリューションに収束する回帰の場合は0に、そのログのK obsの値を制約する必要がある場合があります。

4。構成的受容体の活性を示す細胞ベースのアッセイにおけるアゴニスト濃度反応曲線の測定

  1. M -1の絶対単位でアゴニストK B値の推定については、細胞ベースのin vitroアッセイでは、展示構成的受容体活性ことに使用されています。 Constitutive受容体活性は、関心の受容体の発現に起因する基礎レベル上記の応答の増加として定義されています。
  2. アゴニストを選択し、セクション1.2で上記のような実験を設計する。
  3. それぞれの濃度反応曲線の場合は、非トランスフェクト細胞におけるアゴニストの非存在下(基底応答)で、目的の受容体(基底応答+構成的応答)でトランスフェクトされた細胞の応答を測定します。セクション1.3で説明したように異なるアゴニストの異なる濃度の存在下で反応を測定する。
  4. 受容体でトランスフェクションできない細胞の基底応答マイナスの測定値の応答として構成的受容体活性とアゴニストの各濃度に対する応答を計算する。図6は、非常に低い恒常的な活性を示すシグナル伝達経路のためにこのように算出された様々なアゴニストに対する応答を示しています。

5。予備的恒常的な活性を示すアゴニスト濃度反応曲線のalysis

  1. 3.1節で説明したようにプリズムのデータテーブルにデータ(例えば、図6)を入力するだけでなく、-20のログアゴニストの濃度に対応する適切な文字で表される列内での恒常的な受容体活性に起因する応答を入力します。大きな負の対数はゼロのおおよそのアゴニストの濃度に入力されます。
  2. 2.2節で、それがされるように制約を"ボトム"パラメータで前述のようにデータを分析し、"すべてのデータセット用に共有。" "ボトム"共有" トップ"(E max)を 、コピーし、初期パラメータ推定値の計算に使用するためのExcelスプレッドシートにEC50のパラメータを記録します。
  3. 次のように、初期パラメータ推定値を計算します。

    以前に3説明されている標準的なアゴニスト(LOGK1)またはその他のフル、テストのアゴニストの定数ログ親和性は、別の実験で決定する必要があります。
    ログの初期推定値を計算するK OBSログ{(Top'トップ)/(EC 50(Top'ボトム))}のようにそれぞれの部分的なテストのアゴニストの値(すなわち、この場合にのみLOGK2)、その"下の"構成的受容体の活性化によって引き起こされる応答を示します。

    ログ{トップ/(EC 50下)}として、各アゴニストのログK B(LOGKb)の初期推定値を計算する。

    ログとしてログτSYS(LOGTsys)の初期推定値を計算する{/ボトム(トップ" -ボトム)}。

6。非線形回帰分析を用いて構成的受容体活性を示す応答のためのアゴニストのKB値の推定

  1. 3.1で上記のようなプリズムでデータテーブルにデータを入力してください
  2. twoアゴニストの条件を示すように、ユーザー定義の数式を入力して、複数行でプリズムに、"KB:ログ":
    • <A> LOGKOBS = LOGK1
    • <B> LOGKOBS = LOGK2
    • =(10 ^(X + LOGKOBS))+1
    • B = 10 ^(X + LOGTSYS + LOGKB)
    • C =(10 ^(LOGTSYS))
    • Y = MSYSの/ {1 + [(A /(B + C))^ M]}
  3. 次のように、初期パラメータ推定値を入力します。

    各アゴニストの親和性定数( - ステップ5.3で決定した値を入力LOGK1)を入力します。

    各テストのアゴニストのK obsの推定値を入力します。

    アゴニストのKBの推定値を入力します。

    τSYS(LOGTsys)推定値をログに記録する入力します。

    それぞれ、変換器のスロープファクター(M)およびシステムの最大応答(MSYSの)1.0とトップ "(標準アゴニストのE max)の値を割り当てます。
  4. ; LOGK2とLOGKb、制約のないLOGTsys、MSYSとM、すべてのデータセットのための共有値:次のパラメータの制約を適用します。
  5. 非線形回帰分析を開始する。結果は、標準的なアゴニストのログK B、ログK OBSをもたらすK bの部分アゴニストの値、およびシステムの最大応答(MSYSの)、無料の受容体複合体(LOGTsys)、および運用モデル(M)のトランスデューサのスロープファクターのためのτsys値を記録する。
  6. 回帰が収束しない場合、ポイント3.6の下で、上記の手順に従ってください。

7。代表的な結果

図5は、安定的にM 3ムスカリン性受容体12を発現するチャイニーズハムスター卵巣細胞におけるムスカリン性アゴニスト誘導ホスホイノシチドの加水分解に関する私たちの以前に発行されたデータの一部を示しています。選択されたムスカリン性アゴニストの濃度応答曲線は、このアッセイで測定した。データは、各アゴニストのK bの値を推定するために第3節で上記分析した、オキソトレモリン- Mのように相対的に表現。レコ、これらのログRA iの推定値は、カルバコール、-0.56 ± 0.063です。ライン、-0.60 ± 0.074、ピロカルピン、-1.20 ± 0.15、およびMCN - A - 343、-1.92 ± 0.31。理論曲線は、データ(3.2節)への回帰方程式の最小二乗近似を表す。システムの最大応答(M sys)とトランスデューサのスロープファクター(M)の対応する推定値は53.9 ± 1.3および1.15 ± 0.09、それぞれだった。ログK OBSオキソトレモリン- Mのことを除いてアゴニストの値は、あった、カルバコール、5.19 ± 0.14;アレコリン、5.49 ± 0.12;ピロカルピン、5.58 ± 0.16とMCN - A - 343、5.27 ± 0.33。

図6は、安定してGα153発現HEK293細胞におけるムスカリン性アゴニスト刺激によるホスホイノシチド加水分解実験の結果を示しています。 M 3ムスカリン性受容体の一過性発現は構成的受容体ACTIVに起因した基底ホスホイノシチドの加水分解の増加を引き起こしたITY。データは、セクション6で説明したようにオキソトレモリン- MとMCN - A - 343のログK bの値を推定するために分析した。この分析はそれぞれ、オキソトレモリン- MとMCN - A - 343のために8.30のログK bの値は± 0.59と6.59 ± 0.77が得られた。理論曲線は、データ(セクション6.2を参照)への回帰方程式の最小二乗近似を表す。ログτSYS、M sysMの推定値は-2.29 ± 0.59、95.8 ± 2.8と0.72 ± 0.08、それぞれだった。 Kの推定値は、OBS MCN - A - 343の値は5.35であった± 0.46。

図1
図1単一の受容体活性と受容体の人口の活性化の平均レベルとの関係。 単受容体活性 、transitioを受けて、単一の受容体の理論的挙動アゴニストの存在下でアクティブな間にNS(オン)と非アクティブ(オフ)の状態が表示されます。アクティブと非アクティブな状態のアゴニストの親和性定数はそれぞれ、K bK Aで示されている。 人口の動作は 、アゴニストの存在下でアクティブおよび非アクティブ状態の間のランダムな遷移を受けて、いくつかの受容体の理論的な動作が示されています。 人口平均は 、アゴニストの特定の濃度の存在下で受容体の人口における受容体の活性化の平均レベルが表示されます。受容体の人口の活性化レベルは、刺激として知られています。

図2
アゴニストの図2。受容体の活性化の機能と効果の関係(ε)と観測された親和性定数(K OBS)。人口の平均 、平均レベル活性化はアゴニストの濃度の増加によって誘発される受容体が示されている。 受容体の活性化は 、受容体の活性化の平均レベルは、アゴニストのアゴニストのログの濃度をプロットされます。最大値の半分の受容体の活性化に必要なアゴニストの負の対数濃度は、アゴニスト(ログK OBS)の定数ログ観察された親和性と同等です。受容体の活性化関数の最大値は、有効性(ε)と表記する。

図3
図3。人間のM 3ムスカリン性受容体を発現するチャイニーズハムスター卵巣細胞で様々なムスカリン作動薬による[3 H] inositolphosphateの蓄積の刺激のための濃度-応答曲線の例。 nineアゴニスト濃度反応曲線の合計を測定した。実験は二つの部分に分けることができます。各パートのための、標準的なアゴニスト(oxotremorinEM)は、常に追加のアゴニストと一緒にテストされています。このように、a bに示すように型の二つの実験は、わずか5アゴニストを一度にアッセイすることができればnineアゴニストの濃度-応答曲線を測定する必要があります。データはエイラトからです。12。

図4
図4人間のM 2ムスカリン性受容体とGα15を発現している HEK 293細胞における様々なムスカリン作動薬による[3 H] inositolphosphateの蓄積の刺激のための濃度-応答曲線の例。構成的受容体活性に起因するもの35パーセント[3 H] inositolphosphateの応答、 - M 2受容体の発現は、30を引き起こした。データはエイラトからです。12。

図5
図5。 3ムスカリン性受容体を発現するチャイニーズハムスター卵巣細胞におけるアゴニスト介したホスホイノシチドの加水分解に強い>ムスカリン。刺激的なホスホイノシチド加水分解のための選択されたムスカリン性アゴニストの濃度 - 応答曲線が示されています。三つの実験からの値を平均± SEMを示す。データはエイラトからです。12。

図6
図6。オキソトレモリン- M -とGα15とM 3ムスカリン受容体を発現するHEK293細胞におけるMCN - A - 343 -介したホスホイノシチドの加水分解。ホスホイノシチド加水分解は、オキソトレモリン- MのE maxに相対的に表されます。アゴニストの非存在下で、M 3受容体の発現に起因するホスホイノシチド加水分解は、反応の約2%を占めた。 3つの実験の平均± SEMを示す。 DATAはエイラトからです。3。

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Discussion

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RA I(相対K b値)を推定する手法が唯一のアゴニスト濃度-応答曲線の測定を必要とするため、これらの曲線が測定されるたびに、我々の分析を行うことができます。

実験的な準備(例えば、細胞または組織)の応答における日々の変動が大きい場合は、それぞれの濃度反応曲線の応答の測定は、毎日のための標準的なアゴニストの" トップ "の推定値からの相対値に正規化することができます実験。 トップログEC 50の推定値は、セクション2と5で説明したように回帰分析による標準アゴニストの各レプリケート濃度-応答曲線のために推定されている。特定の日のアゴニスト濃度反応曲線のすべての応答値は、その日のための標準的なアゴニストのトップ見積もりからの相対値に正規化されています。 beginn上述したようにこれらの正規化されたデータを分析しています第3節ではING。

K bを推定する精度は、構成的受容体活性の正確な推定に依存する。私たちの場合は、HEK 293細胞におけるM 3受容体のトランスフェクションは、約500から遠隔ホスホイノシチド加水分解の増加を引き起こした- 1000細胞のリチウムの存在下で測定されたのcpmの[3 H] inositolphosphates [3H]イノシトールであらかじめ標識した。カルバコールに対する最大応答は約50,000でした - 60,000 cpmを。構成的応答は、オキソトレモリン- MとMCN - A - 343のK bの値の見積りを大きくし、少ない変数れていたが、より正確にされていました。 K bの推定は、運用モデルの変換器のスロープファクター(M)の正確な推定値があるかどうかで決まります。セクション1.3で推奨されているようアゴニストの濃度がより密接に間隔をあけていた場合、その結果、より精度が達成されている可能性があります。 Runni実験でNG追加アゴニストも大幅にK bMの推定値の正確さ、それゆえに、増加する。

異なる結合タンパク質(例えば、Gタンパク質)を介して信号その受容体の異なるアクティブな状態がある場合は、分析の手法は、それぞれのエフェクター経路3,6のアゴニストK bRA i値の正確な推定を提供します。複数のアクティブな状態では、単一の測定された応答に寄与している場合は、RA IK bの推定の手法は、それらの相対量とアクティビティ3に応じて、異なるアクティブな状態の加重平均を表しています。

構成的受容体活性は、GPCRおよびその相補的Gタンパク質13を過剰発現により誘導され得る。これは、観測された親和性およびアゴニスト - 受容体複合体の効果を変更することがあり、非Pを引き起こす可能性がありますhysiologicalシグナリング。しかし、応答の性質の変化と受容体の個体群の観察された親和性および有効性は、受容体の基本的な量子状態の変化、のみ、その数の変化と異性化の確率を意味するものではありません。このように、G蛋白質はあまり受容体の異なるエフェクター - 選択状態にかぶせたウィンドウのようにあまり薬の効果の決定要因ではありません。アゴニストのバイアスの究極の測定-分析の手法(例えば、Gタンパク質)単一のエフェクターを含む特定のGPCRシグナリングアッセイに適用されている場合には、受容体のエフェクター選択的状態に対してアゴニストK B値を測定することができるはずです。

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Disclosures

利害の衝突は宣言されません。

Acknowledgments

この作品は、健康グラントGM 69829の国立研究所によってサポートされていました。

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Gタンパク質共役受容体でアゴニスト活性を定量化
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Ehlert, F. J., Suga, H., Griffin, M. T. Quantifying Agonist Activity at G Protein-coupled Receptors. J. Vis. Exp. (58), e3179, doi:10.3791/3179 (2011).More

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