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Biology

Quantificar atividade agonista no G receptores acoplados à proteína

doi: 10.3791/3179 Published: December 26, 2011

Summary

Um método para estimar a afinidade constante de um agonista para o estado ativo (

Abstract

Quando um agonista ativa uma população de G receptores acoplados à proteína (GPCRs), ele provoca uma via de sinalização que culmina na resposta da célula ou tecido. Este processo pode ser analisado a nível de um único receptor, uma população de receptores, ou uma resposta a jusante. Aqui nós descrevemos como analisar a resposta a jusante para obter uma estimativa da afinidade agonista constante para o estado ativo de receptores único.

Receptores se comportam como chaves quântica que se alternam entre os estados ativo e inativo (Figura 1). O estado ativo interage com as proteínas G específicas ou outros parceiros de sinalização. Na ausência de ligantes, o estado inativo predomina. A ligação do agonista aumenta a probabilidade de que o receptor muda para o estado ativo porque sua afinidade constante para o estado ativo (K b) é muito maior do que para o estado inativo (K a). A soma dossaídas aleatória de todos os receptores da população gera um nível constante de ativação do receptor no tempo. O inverso da concentração de agonista provocando meio máxima ativação do receptor é equivalente ao constante de afinidade observada (obs K), ea fração de agonista do receptor-complexos no estado ativo é definido como a eficácia (ε) (Figura 2).

Métodos para analisar as respostas a jusante de GPCRs foram desenvolvidos que permitem a estimativa do K obs e eficácia relativa de um agonista de 1,2. Neste relatório, vamos mostrar como modificar essa análise para estimar o valor de K agonista b em relação à de outro agonista. No caso de ensaios que exibem atividade constitutiva, mostramos como estimar K b em unidades absolutas de M -1.

Nosso método de análise agonista curvas concentração-resposta consiste 3,4de regressão não-linear global usando o modelo operacional 5. Nós descrevemos um procedimento usando o aplicativo de software, Prism (GraphPad Software, Inc., San Diego, CA). A análise fornece uma estimativa do produto da K obs e um parâmetro proporcional à eficácia (τ). A estimativa de τK obs de um agonista, dividido pelo de outra, é uma medida relativa de K b (RA i) 6. Para qualquer receptor exibindo atividade constitutiva, é possível estimar um parâmetro proporcional à eficácia do complexo receptor livre sys). Neste caso, o valor de K b de um agonista é equivalente a τK obs / τ sys 3.

Nosso método é útil para determinar a seletividade de um agonista de subtipos do receptor e para a quantificação agonista do receptor de sinalização através de diferentes proteínas G.

Protocol

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1. Medição de agonista curvas concentração-resposta: sem atividade constitutiva

  1. Para a estimativa de valores em relação agonista K b (RA i), uma série de pelo menos dois agonista curvas concentração-resposta é necessária. Qualquer ensaio in vitro para a resposta funcional de um GPCR pode ser medida desde que a concentração de agonista pode ser controlada e um único tipo de receptor medeia a resposta. Adequada baseada em células incluem ensaios de medição de AMPc 4,7 e acumulação inositolphosphate 8,9 em uma linha de células expressando um receptor recombinante. Exemplos de ensaios de tecido inteiro incluem a medição da contração do músculo liso 10 ou M-receptor e 2 muscarínicos β 1-adrenoceptor mediada alterações na contração do rato em campo estimulado átrio esquerdo 11.
  2. Escolha uma série de agonistas para análise, incluindo um agonista altamente eficaz(Ligante, por exemplo, endógena). Em um determinado experimento, medida completa curvas concentração-resposta para cada agonista. Se o número de agonistas é muito grande para completar o ensaio em um único experimento, divide os agonistas em subgrupos, cada um consistindo de um número razoável de agonistas para um único experimento. Para cada subgrupo, medir a curva de concentração-resposta do agonista altamente eficaz, juntamente com os dos outros agonistas no subgrupo (ver Figura 3). Repita a experiência para cada subgrupo 3-6 vezes, aproximadamente, dependendo da variabilidade dos dados.
  3. Para cada curva de concentração-resposta, medir a resposta na ausência de agonista (resposta basal), e na presença de concentrações crescentes de agonista. Espaço as concentrações agonista uniformemente em uma escala log aproximadamente a cada 0,3-0,7 log 10 unidades, que cobrem a gama de respostas e na definição da resposta máxima (E máx) (ver Figura 3). Para experimentos em linhas de células, cada medição é feita em triplicado.
  4. Subtrair a resposta basal daquele medido na presença de cada concentração do agonista. As respostas plotados na Figura 3 foram calculados desta maneira.

2. Análise preliminar de agonista curvas concentração-resposta: sem atividade constitutiva

  1. Inserir os dados dos experimentos concentração-resposta (por exemplo, a Figura 5) em uma tabela de dados em Prism. Todas as concentrações de agonista log são inseridos sob a coluna marcada X. As medidas de resposta para o agonista que parece ter o maior valor máximo E é introduzido na coluna A, e aqueles para o agonista que as outras pessoas entraram em colunas adjacentes letras. Medições repetidas de uma das curvas concentração-resposta são inseridos no sub-colunas de uma determinada coluna com letras.
  2. Seleccione a folha de gráfico em que os dados são plotados, e analisar os dados por análise de regressão não-linear usandodireito da equação, log (agonista) versus resposta - inclinação variável (quatro parâmetros). Restringir o "Bottom" parâmetro para zero, e realizar a análise de regressão. Copie o "Top" (E max) e log EC 50 parâmetros em uma planilha Excel para uso no cálculo das estimativas dos parâmetros iniciais. O agonista com a maior estimativa de E max é designado como o "agonista padrão", enquanto os outros agonistas são designados como "agonistas teste".
  3. Calcular a estimativa inicial de log τK obs (LOGR1) como o log negativo CE 50 valor do agonista padrão (log-CE 50 ').

    Calcular a estimativa inicial do RA log i valor de cada agonista de teste (LOGRA) como log {(Top * EC 50 ') / (Top' * EC 50)}, em que os parâmetros do agonista padrão são indicadas com um apóstrofo .

    Calcular o log afinidade conbalcões dos agonistas de teste (LOGK2 - LOGK5) como o logaritmo negativo de seus respectivos valores de CE 50.

3. Estimativa de valores agonista RAi usando análise de regressão não-linear: nenhuma atividade constitutiva

  1. Inserir os dados em uma tabela de dados no Prism, como descrito acima no ponto 2.1. Certifique-se que os dados para o padrão agonista são inseridos na coluna A.
  2. Digite um user-defined equação, "log RAi", em Prism em várias linhas, como mostrado para o caso envolvendo um total de cinco agonistas:
    • <A> P = LOGK1
    • <A> Q = LOGR
    • <~ A> Q = + LOGR LOGRA
    • <B> P = LOGK2
    • <C> P = LOGK3
    • <D> P = LOGK4
    • <E> P = LOGK5
    • Y = Msys / (1 + {[(1 +10 ^ (X + P)) / (10 ^ (X + Q))] ^ M})
  3. Inscreverá as estimativas iniciais dos parâmetros da seguinte forma:
    Digite um valor arbitrariamente baixa de 0 para a constante de afinidade log (LOGK1) do agonista padrão.

    Digite a estimativa inicial dosLOGR e as constantes de afinidade (LOGK2 - LOGK5) e log valores Rai (LOGRA) dos agonistas de teste.

    Atribuir a estimativa inicial do fator de inclinação transdutor (M) um valor de 1.0.

    Atribuir a estimativa inicial para a resposta máxima do sistema (Msys) um valor equivalente ao máximo E do agonista padrão (Top).
  4. Aplicar as restrições seguinte parâmetro: LOGK1 restrito ao constante, 0; LOGR1, Msys e M, valor compartilhado para todos os conjuntos de dados; LOGK2 - LOGK5 e LOGRA, sem restrições.
  5. Iniciar a análise de regressão não-linear. Os resultados de rendimento do K log obs e RA log i valores dos agonistas de teste. Se o padrão agonista é um agonista completo, então o tanto o log K obs e valores log RA i são precisos. Se o agonista mais eficaz (agonista standard) é na verdade um agonista parcial, então o K obs valores da ag mais eficazonists pode ser superestimada. No entanto, as estimativas de log RA i ainda são precisos nesta situação.
  6. Se a regressão não convergir, o experimentador pode querer construir a curva teórica definida pela estimativa do parâmetro inicial. Se existem grandes desvios entre os pontos de dados e as curvas teóricas, verifique o cálculo da estimativa do parâmetro inicial. Se um ou mais agonistas têm E max valores equivalentes ao do agonista padrão, pode ser necessário para restringir sua log K obs valores a 0 para a regressão a convergir para uma solução.

4. Medição de agonista curvas concentração-resposta na célula com base em ensaios exibindo atividade do receptor constitutivo

  1. Para a estimativa dos valores agonista K b em unidades absolutas de M -1, baseada em células em ensaios in vitro são utilizados, que exibem atividade do receptor constitutivo. Constituiçãotiva atividade do receptor é definida como o aumento da resposta acima do nível basal causados ​​pela expressão do receptor de interesse.
  2. Escolha agonistas e desenho do experimento, como descrito acima no ponto 1.2.
  3. Para cada curva de concentração-resposta, medir a resposta na ausência de agonista não-transfectadas células (resposta basal) e em células transfectadas com o receptor de interesse (resposta basal + resposta constitutiva). Medir a resposta na presença de diferentes concentrações dos agonistas diferentes, conforme descrito acima na Seção 1.3.
  4. Calcular a atividade do receptor constitutivo ea resposta a cada concentração do agonista como a resposta medida menos a resposta basal em células não transfectadas com o receptor. A Figura 6 mostra as respostas aos agonistas vários calculado desta maneira para uma via de sinalização exibem muito baixa atividade constitutiva.

5. Preliminar umalysis agonista de curvas concentração-resposta exibindo atividade constitutiva

  1. Inserir os dados (por exemplo, a Figura 6) em uma tabela de dados no Prism conforme descrito na Seção 3.1, mas também inserir a resposta causada pela atividade do receptor constitutivo nas colunas apropriadas letras que corresponde a uma concentração de agonista log de -20. A grande logaritmo negativo é inserido para uma concentração aproximada agonista de zero.
  2. Analisar os dados, conforme descrito acima na Seção 2.2, mas com o parâmetro "Bottom" limitada, de forma que é "compartilhada por todos os conjuntos de dados." Copie o "Top" (E max), compartilhada "Bottom" e log EC50 parâmetros em uma planilha Excel para uso no cálculo das estimativas dos parâmetros iniciais.
  3. Calcular as estimativas iniciais dos parâmetros da seguinte forma:

    A afinidade log constante do agonista padrão (LOGK1) ou qualquer agonista completo de ensaios, deve ser determinada em experimentos separados como descrito anteriormente 3
    Calcular a estimativa inicial do log K obs valor de cada teste agonista parcial (ou seja, somente LOGK2 neste caso) como log {(Top' Top) / (EC 50 (Top' Bottom-))}, em que "Bottom "denota a resposta causada pela ativação do receptor constitutivo.

    Calcular a estimativa inicial de log K b (LOGKb) para cada agonista como log {Top / (EC 50 Bottom)}.

    Calcular a estimativa inicial de log τ sys (LOGTsys) como log {/ Inferior ('Top - Bottom)}.

6. Estimativa de valores Kb agonista de respostas exibindo atividade do receptor constitutivo usando análise de regressão não-linear

  1. Inserir os dados em uma tabela de dados no Prism, como descrito acima no ponto 3.1
  2. Digite um user-defined equação, "Log Kb", em Prism em várias linhas, como mostrado para a condição de dois agonistas:
    • <A> LOGKOBS = LOGK1
    • <B> LOGKOBS = LOGK2
    • A = (10 ^ (X + LOGKOBS)) +1
    • B = 10 ^ (X + + LOGTSYS LOGKB)
    • C = (10 ^ (LOGTSYS))
    • Y = Msys / {1 + [(A / (B + C)) ^ M]}
  3. Inscreverá as estimativas iniciais dos parâmetros da seguinte forma:

    Digite as constantes de afinidade de cada um agonista (LOGK1 - digite o valor determinado no passo 5.3).

    Digite o K obs estimativas de cada agonista de teste.

    Inscreverá as estimativas Kb dos agonistas.

    Digite log τ sys estimativa (LOGTsys).

    Atribuir o fator de inclinação transdutor (M) e da resposta máxima do sistema (Msys) valores de 1,0 e 'Top (E max do agonista padrão), respectivamente.
  4. Aplicar as restrições seguinte parâmetro: LOGTsys, Msys e M, valor compartilhado para todos os conjuntos de dados; LOGK2 e LOGKb, sem restrições.
  5. Iniciar a análise de regressão não-linear. Os resultados de rendimento do log K b do agonista padrão, o log K obs K b de agonistas parciais, e da resposta máxima do sistema (Msys), o valor de τ sys para o complexo receptor livre (LOGTsys), eo fator de inclinação transdutor no modelo operacional (M).
  6. Se a regressão não convergir, siga os passos descritos acima no ponto 3.6.

7. Resultados representante

A Figura 5 mostra alguns dos nossos dados publicados anteriormente em muscarínicos induzida por agonista hidrólise fosfatidilinositol em células de ovário de hamster chinês expressando estavelmente o receptor muscarínico M 3 12. As curvas de concentração-resposta de agonistas muscarínicos selecionados foram medidos neste ensaio. Os dados foram analisados, conforme descrito acima na secção 3 para estimar o valor de K b de cada agonista, expressa em relação à de oxotremorine-M. Estas estimativas log RA i são, carbacol, -0,56 ± 0,063; Arecolinha, -0,60 ± 0,074; pilocarpina, -1,20 ± 0,15; e McN-A-343, -1,92 ± 0,31. As curvas teóricas representam o ajuste por mínimos quadrados da equação de regressão aos dados (seção 3.2). As estimativas correspondentes da resposta máxima do sistema (M sys) eo fator de inclinação transdutor (M) foram 53,9 ± 1,3 e 1,15 ± 0,09, respectivamente. O log K obs valores dos agonistas, excepto a oxotremorine-M foram, carbacol, 5,19 ± 0,14; arecolina, 5,49 ± 0,12; pilocarpina, 5,58 ± 0,16 e McN-A-343 de 5,27 ± 0,33.

A Figura 6 mostra os resultados de experiências sobre a hidrólise de agonistas muscarínicos estimulado fosfatidilinositol em células HEK 293 estavelmente expressar G α15 3. Expressão transitória do 3 M receptor muscarínico causou um aumento na hidrólise de fosfatidilinositol basal, que foi atribuída a atividade constitutiva do receptorlidade. Os dados foram analisados ​​para estimar os valores log K b de oxotremorine-M e McN-A-343 como descrito na secção 6. Esta análise resultou em valores de log K b de 8,30 ± 0,59 e 6,59 ± 0,77 para oxotremorine-M e McN-A-343, respectivamente. As curvas teóricas representam o ajuste por mínimos quadrados da equação de regressão aos dados (ver Seção 6.2). As estimativas de log τ sys, sys M e M foram -2,29 ± 0,59, 95,8 ± 2,8 e 0,72 ± 0,08, respectivamente. A estimativa do valor de K obs 343-McN-A foi 5,35 ± 0,46.

Figura 1
Figura 1. Relação entre a atividade do receptor único e do nível médio de ativação do receptor população. Atividade do receptor único, o comportamento teórico de um único receptor submetidos Transitions entre ativo (On) e inativos (Off) afirma, na presença de um agonista é mostrado. As constantes de afinidade do agonista para os estados ativo e inativo são denotados por K b e K, respectivamente. Comportamento da população, o comportamento teórico de vários receptores submetidos transições aleatórias entre os estados ativo e inativo na presença de um agonista é mostrado. População média, o nível médio de ativação do receptor em uma população de receptores na presença de uma concentração específica de agonista é mostrado. O nível de ativação da população receptor é conhecido como o estímulo.

Figura 2
Figura 2. Relação entre a função de ativação de receptores ea eficácia (ε) e constante de afinidade observada (obs K) da média agonista. População, o nível médio deativação do receptor provocada por aumento das concentrações de agonista é mostrado. ativação do receptor, o nível médio de ativação do receptor agonista é plotado a concentração log de ​​agonista. A concentração de log negativo de agonista necessário para que metade-máxima ativação do receptor é equivalente à afinidade de log observado constante do agonista (log K obs). O máximo da função de ativação do receptor é denotado como eficácia (ε).

Figura 3
Figura 3. Exemplos de curvas concentração-resposta para a estimulação de [3 H] acumulação inositolphosphate por vários agonistas muscarínicos em células de ovário de hamster chinês expressando o ser humano M 3 receptores muscarínicos. Um total de nove agonista curvas concentração-resposta foram medidos. O experimento pode ser dividido em duas partes. Para cada parte, o agonista padrão (oxotremorinEM) é sempre testado em conjunto com agonistas adicionais. Assim, dois experimentos do tipo mostrado em a e b são obrigados a medir as curvas de concentração-resposta de nove agonistas se apenas cinco agonistas podem ser analisadas de uma só vez. Os dados são da Ehlert et al. 12.

Figura 4
Figura 4. Exemplos de curvas concentração-resposta para a estimulação de [3 H] acumulação inositolphosphate por vários agonistas muscarínicos em HEK 293 células que expressam o receptor M 2 humana muscarínicos e G α15. Expressão do receptor 2 M causou um 30-35% [3 H] inositolphosphate resposta, que foi atribuída a atividade do receptor constitutivo. Os dados são da Ehlert et al. 12.

Figura 5
Figura 5. 3 receptores muscarínicos. As curvas de concentração-resposta de agonistas muscarínicos selecionados para a hidrólise fosfatidilinositol estimulando são mostrados. Os valores médios de três experimentos ± SEM são mostrados. Os dados são da Ehlert et al. 12.

Figura 6
Figura 6. Oxotremorine-M e McN-A-343-hidrólise mediada fosfatidilinositol em HEK 293 células que expressam G α15 eo receptor muscarínico M 3. Hidrólise fosfatidilinositol é expressa em relação ao máximo de E oxotremorine-M. Na ausência de agonista, a hidrólise fosfatidilinositol atribuída a expressão do receptor 3 M representaram aproximadamente 2% da resposta. O meio de três experimentos ± SEM são mostrados. O data são de Ehlert et al. 3.

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Discussion

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Porque o nosso método para estimar RA i (em relação K valor b) só exige a medição de agonista curvas concentração-resposta, a nossa análise pode ser feito a qualquer hora dessas curvas são medidos.

Se o dia-a-dia variação na resposta da preparação experimental (por exemplo, células ou tecidos) é grande, as medidas de resposta de cada curva de concentração-resposta pode ser normalizada em relação à estimativa de "Top" do agonista padrão para cada dia experimento. Uma estimativa do Top log e EC 50 é estimada para cada curva de concentração-resposta replicar do agonista padrão pela análise de regressão, conforme descrito nas Seções 2 e 5. Os valores de resposta de todos os agonistas curvas concentração-resposta em um determinado dia são normalizados em relação à estimativa Top do agonista padrão para esse dia. Estes dados normalizados são então analisados ​​como descrito acima beginning na Seção 3.

A precisão da estimativa de K b depende de uma estimativa precisa da atividade do receptor constitutivo. No nosso caso, transfecção dos 3 M receptor em células HEK 293 causou um aumento na hidrólise de fosfatidilinositol que variaram de cerca de 500 - 1.000 cpm de [3 H] inositolphosphates medido na presença de lítio em células pré-marcadas com [3H] inositol . A resposta máxima de carbacol foi de cerca de 50.000 - 60.000 cpm. Tinha a resposta constitutiva sido maior e menos variável, nossa estimativa dos valores K b da oxotremorine-M e McN-A-343 teria sido mais preciso. A estimativa de K b também depende de se ter uma estimativa precisa do fator de inclinação transdutor (M) no modelo operacional. Conseqüentemente, mais precisão poderia ter sido alcançado se as concentrações de agonista eram mais espaçados, como recomendado na secção 1.3. Running agonistas adicionais no experimento também aumenta muito a precisão da estimativa de M, e, portanto, de K b.

Se existem diferentes estados ativos do receptor que o sinal através de proteínas de ligação diferentes (por exemplo, proteínas G), então o nosso método de análise fornece uma estimativa precisa de agonista K b e i RA valores para cada via efetora 3,6. Se mais de um estado ativo contribui para uma única resposta medido, então o nosso método de estimativa da RA I e K b representa uma média ponderada dos diferentes estados ativos, dependendo de sua abundância relativa e atividade 3.

Atividade do receptor constitutiva pode ser induzida por mais de expressar o GPCR e sua proteína G complementares 13. Isso pode alterar a afinidade observada e eficácia do complexo agonista-receptor e pode causar não-psinalização hysiological. Mas as mudanças na natureza da resposta ea afinidade observados e eficácia da população dos receptores não implicam mudanças nos estados fundamentais quantal do receptor, apenas uma mudança no seu número e probabilidade de isomerização. Assim, as proteínas G não são tanto um determinante de efeitos de drogas tanto como uma janela para diferentes estados efetoras seletivo do receptor. Se o nosso método de análise é aplicada a ensaios GPCR específicos de sinalização envolvendo um único efetor (por exemplo, a proteína G) que deve ser possível medir valores agonista K b para efetoras seletivo estados do receptor - a última medida de viés agonista.

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Disclosures

Não há conflitos de interesse declarados.

Acknowledgments

Este trabalho foi financiado por um dos Institutos Nacionais de Saúde Grant GM 69829.

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Ehlert, F. J., Suga, H., Griffin, M. T. Quantifying Agonist Activity at G Protein-coupled Receptors. J. Vis. Exp. (58), e3179, doi:10.3791/3179 (2011).More

Ehlert, F. J., Suga, H., Griffin, M. T. Quantifying Agonist Activity at G Protein-coupled Receptors. J. Vis. Exp. (58), e3179, doi:10.3791/3179 (2011).

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