隔离从小鼠胚胎的脊髓运动神经元的另一种方法是描述。该方法考虑外源凝集素,可以绑定到低亲和力神经生长因子受体P75NTR的事实。基于这种外源凝集素preplating允许一个类似与P75NTR对特定抗体的纯化。
脊髓运动神经元对有丝分裂阶段发展,通过早期胚胎神经系统发育和后来生长出来树突和轴突。神经管神经上皮细胞表达Nkx6.1独特的前体细胞对脊髓运动神经元 1 。虽然有丝分裂运动神经元的走向他们的最终位置,并自己组织成列沿脊髓束2,3。超过90%,所有这些差异化和定位的运动神经元表达的转录因子胰岛1 / 2。他们支配四肢的肌肉,以及身体和内脏的。其中,运动神经元表达脑源性神经营养因子(BDNF)和神经营养因子-3(NT – 3),原肌球蛋白相关激酶B和C(的TrkB,TrkC)的高亲和力受体。他们不表达的原肌球蛋白相关激酶A(TrkA的)4。旁边的两个高亲和力受体,运动神经元表达低亲和力神经营养因子受体p75的正常贸易关系 。 p75的正常贸易关系可以相似,但低亲和力结合所有的神经营养因子,神经营养因子比所有的高亲和力受体结合成熟的神经营养因子。在胚胎的脊髓中,p75的正常贸易关系完全是由5脊髓运动神经元表达。这已被用于发展运动神经元的隔离技术,净化绝大多数的细胞周围的细胞 6 。隔离运动神经元特异性抗体对p75的正常贸易关系的外域(平移)的帮助下却变成了一次实验中使用的抗体量高是由于为平移板的大小是一个昂贵的方法。一个更为经济的另一种方法是使用凝集素。已被证明外源凝集素特异性结合p75的正常贸易关系 ,以及7。下面的方法介绍了一种替代技术,使用一个preplating过程,而不是p75的正常贸易关系抗体麦胚凝集素。凝集素是一个非常便宜的替代p75 的正常贸易关系的抗体和净化等级使用外源凝集素与p75的正常贸易关系抗体。可以用这种方法分离出胚胎脊髓运动神经元,生存和发展,突起。
基于此凝集素preplating技术的优点是,它是低于p75 的正常贸易关系为基础的平移过程昂贵,和外源凝集素是超过抗体稳定。浓缩列图。 2和标签。 1显示了该程序允许细胞相似的净化和大多数这些细胞表达了运动神经元标记胰岛- 1 / 2。最关键的一步是腰椎脊髓的分离过程。删除的脑膜和背根节(图2)以下的外源凝集素为基础的preplating纯化过程是必不可少的。如果这一直是正确的管理,几乎所有的细胞表达p75的正常贸易关系 (有代表性的图片,请参见图3a )。胰岛- 1 / 2和p75的正常贸易关系是最有可能的表达之间的区别的原因是因为腰的运动神经元的差异表达上级与下级的胰岛– 1 / 2 10。在胰岛- 1 / 2的表达水平低的情况下,这有可能逃脱immuncytochemical染色和随后的计算中我们的注意力,因为我们是积极与消极的细胞(表1)严格。此外,表1清楚地表明,分离的细胞在一个健康的条件下生存的过程,因为只有几台盼蓝阳性细胞,表明细胞是不可逆的损坏。这种变质的过程,也允许从单一胚胎及胚胎小鼠的混合基因型垃圾因此运动神经元的隔离。总之,这与正常贸易关系的P75抗体6平移过程的替代也有类似的的,如果不是在可能的应用范围相同的能力,提供了一种廉价而高效的的小鼠胚胎运动神经元替代的提纯方法。
The authors have nothing to disclose.
我们感谢桑德拉巴根出色的技术支持。这项工作是支持的蛋白质研究部(下称“珠三角”,总磷A1.2(RC和TS),擦研究情有独钟,Rektoratsprogramme – wissenschaftlicher Nachwuchs(AK)单克隆抗体39.4D5和F55A10发展研究杂交瘤细胞银行(DSHB,爱荷华城,IA)。
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
Poly-DL-ornithine hydrobromide | Sigma | P8638 | |
Laminin | Invitrogen | 23017-015 | |
HBSS | Gibco | 14170 | |
Glass coverslips | Thermo | Ø 10 or 14mm | |
Lectin | Sigma | L5142 | |
Cell culture dish | Nunc | 150350 | Nunclon delta surface |
Horse serum | Linaris | SHD3250ZK | Each batch has to be tested for MN culture |
B27 Supplement | Gibco | 17504-044 | |
Glutamax | Gibco | 35050-038 | |
CNTF | Sigma | N0513 | |
BSA | Applichem | A1391 | |
Neurobasal | Gibco | 21103-041 | |
Forceps | Stainless steel, size 4 or 5 | ||
Trypsin | Worthington | LS003707 | |
Trypsin-Inhibitor | Sigma | T6522 | |
Anti-Islet-1 | DSHB | 39.4D5 | Cell culture supernatant |
Anti-Nkx6.1 | DSHB | F55A10 | Cell culture supernatant |
Anti-p75NTR | Abcam | Ab8874 |
Table 3. Table of specific reagents and equipment.