척수에서 마우스 배아 motoneurons를 분리의 대체 방법이 설명되어 있습니다. 방법은 계정에 렉틴은 낮은 친화 신경 성장 인자 수용체 p75NTR에 바인딩할 수있다는 사실이 걸립니다. 이 렉틴과 기반 preplating는 p75NTR에 대한 특정 항체와 비슷한 정화 수 있습니다.
척추 motoneurons 일찍 배아 신경 시스템 개발을 통해 postmitotic 단계 향해 개발하고 이후 dendrites과 axons을 성장. 표현 Nkx6.1가 척추 motoneurons 1 고유의 전구체 세포되는 신경 튜브 Neuroepithelial 세포. postmitotic의 motoneurons 그들의 최종 위치를 향해 이동하고 척추 넓이 2,3 따라 열로 자신을 정리했지만. 이러한 모든 차별과 위치 motoneurons의 90 % 이상이 전사 요인에게 섬 1 / 2 표현한다. 그들은 사지의 근육뿐만 아니라 신체 내부의 장기들을 신경을 분포시키다. 다른 사람들과 motoneurons 일반적으로 두뇌 파생 neurotrophic 인자 (BDNF) 및 Neurotrophin – 3 (NT – 3), tropomyosin 관련 키나제 B와 C (TrkB, TrkC)의 고친 화성 수용체를 표현한다. 그들은 tropomyosin 관련 키나제 A (TrkA) 4을 표현하지 않습니다. 두 고친 화성 수용체 게다가, motoneurons은 낮은 친화 neurotrophin 수용체 p75 NTR을 표현 않습니다. p75 NTR은 성숙 neurotrophins를 바인딩시킬 고친 화성 수용체보다 모든 neurotrophins과 비슷하지만, 낮은 친화력있는 모든 neurotrophins을 바인딩할 수 있습니다. 배아 척수 내에서 p75 NTR은 독점적으로 척추 motoneurons 5 표시됩니다. 이것은 주변 세포 6 대부분의 세포를 정화 motoneuron 절연 기술을 개발하는 데 사용되었습니다. p75 NTR의 세포외 도메인에 대한 특정 항체 (패닝)의 도움으로 분리 motoneurons은 하나의 실험에 사용되는 항체의 양이 높은 패닝에 사용되는 접시의 크기로 인해대로 고가의 방법으로 밝혀졌다 있습니다. 훨씬 더 경제적인 대안은 렉틴를 사용하는 것입니다. 렉틴과은 특히뿐만 아니라 7 p75 NTR에 바인딩을 보여줘왔다. 다음과 같은 방법 대신 p75 NTR 항체의 preplating 절차 밀 배아 agglutinin을 사용하여 다른 방법을 설명합니다. 렉틴과는 p75 NTR 항체의 비교 아르 렉틴를 사용하여 p75 NTR 항체 및 정화 등급으로 매우 저렴한 대안입니다. 배아 척수에서 Motoneurons이 방법에 의해 격리 수 있으며, 생존과 neurites을 성장.
이 렉틴과 기반 preplating 기법의 장점은 p75 NTR 기반 패닝 절차보다 비싼 것이 있으며, 렉틴는 항체보다 더 안정적입니다. 농축는 그림에 나와있는. 2 탭. 절차는 세포의 유사한 숫자의 정화 수 있으며 이러한 세포의 과반수는 것을 보여주는 하나의 motoneuron 마커 섬 – 1 / 2 표현한다. 가장 중요한 단계는 요추 척수에 대한 격리 절차입니다. meninges과 DRGs (그림 2) 제거하면 렉틴 기반 preplating하여 다음 정화 절차 필수적입니다. 이것이 제대로 관리되고있다면, 거의 모든 세포는 (대표 사진 그림을 참조하십시오. 3a를) p75 NTR을 표현. 섬 – 1 / 2의 표현과 p75 NTR 가장 분명 차이에 대한 이유는 허리 motoneurons가 differentially 섬 – 1 / 2 10보다 높은 낮은 수준을 표현하기 때문에. 우리가 긍정 대 부정적인 세포 (Tab. 1)에 대하여 엄격한 것처럼 섬 – 2분의 1 표현의 낮은 수준의 경우 이것은 immuncytochemical 얼룩과 후속 계산에서 우리의 주목을 탈출 할 수도 있습니다. 또한, 표 1은 분명히 세포가 레스터 손상되었음을 나타냅니다 겨우 몇 trypan 블루 긍정적인 세포가로 분리된 세포가 건강한 상태에있는 절차를 생존 것을 보여줍니다. 이 바꾸는 절차는 또한 배아 생쥐에서 혼합 유전자형의 새끼의 단일 배아 따라서에서 motoneurons의 고립 수 있습니다. 결론적으로, p75 NTR 항체 6 패닝 절차이 대안이 비슷한가 없다면 동일한 용량을 가능한 응용 프로그램 범위의 관점에서 마우스 배아 motoneurons을위한 저렴하고 효율적인 대안 정화 방법을 제공합니다.
The authors have nothing to disclose.
우리는 우수 기술 지원 산드라 Bargen 감사합니다. 이 작품은 단백질 연구 부서 (PRD, TP A1.2 (RC와 TS), 그리고 문질러 연구 좋아, Rektoratsprogramme에 의해 지원되었다 -. wissenschaftlicher Nachwuchs (AK) 단클론 항체 39.4D5와 F55A10이 발달 연구 하이 브리 도마에서 얻은되었습니다 은행 (DSHB, 아이오와시, IA).
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
Poly-DL-ornithine hydrobromide | Sigma | P8638 | |
Laminin | Invitrogen | 23017-015 | |
HBSS | Gibco | 14170 | |
Glass coverslips | Thermo | Ø 10 or 14mm | |
Lectin | Sigma | L5142 | |
Cell culture dish | Nunc | 150350 | Nunclon delta surface |
Horse serum | Linaris | SHD3250ZK | Each batch has to be tested for MN culture |
B27 Supplement | Gibco | 17504-044 | |
Glutamax | Gibco | 35050-038 | |
CNTF | Sigma | N0513 | |
BSA | Applichem | A1391 | |
Neurobasal | Gibco | 21103-041 | |
Forceps | Stainless steel, size 4 or 5 | ||
Trypsin | Worthington | LS003707 | |
Trypsin-Inhibitor | Sigma | T6522 | |
Anti-Islet-1 | DSHB | 39.4D5 | Cell culture supernatant |
Anti-Nkx6.1 | DSHB | F55A10 | Cell culture supernatant |
Anti-p75NTR | Abcam | Ab8874 |
Table 3. Table of specific reagents and equipment.