Summary
이 문서의 목적은 디지털 immunofluorescent 현미경을 사용하여 쥐 pial 동맥 조각에 에스 트로겐 수용체 - α의 immunofluorescent 감지 (ERα)를 최적화하는 방법을 설명하는 것입니다.
Abstract
혈관 반응에 대한 에스 트로겐의 효과의 대부분은 에스 트로겐 수용체 1, 2, 3 상호 작용을 통해 중재 수 있습니다. 두 개의 하위 유형 (에스 트로겐 수용체 - α와 β)를 존재하지만, 에스 트로겐 수용체 - α는 부드러운 근육 모두에서 공촛점 레이저 현미경 4 스캔과 함께 형광 염색법을 사용하여 pial 동맥 세그먼트의 내피 세포에서 발견되었습니다. 또한, ER - α는 핵과 쥐의 두개골 기저부의 동맥 5 세포질에 위치하고 있습니다. 수용체가 풍부하고 밝게 형광하지만, 수용체의 개별 그룹의 명확한 시각화 가능성이 높습니다 pial 선박 세그먼트의 많은 세포 레이어에있는 숫자로 인해 어렵습니다. 또한, immunohistochemical 기술을 사용하여 많은 리포트가 제대로 공촛점 현미경 세부 실험 6의 재생산을위한 중요한 요구와 결합하여. 이 기사에 대한 우리의 목적은 T를 최적화하는 간단한 기술을 설명하는 것입니다그는 ER - α의 얼룩과 시각화는 여성 쥐의 두뇌에서 얻는 pial arterioles의 교차 단면 슬라이스를 사용합니다. 우리는 먼저 우리가 쉽게 해부 현미경으로 분리 표면 pial 동맥을 확인하기 위해 에반스 청색 염료로 쥐나 perfuse. 동맥 8 μm의 교차 부분을 슬라이스하는 그라 이오 스탯의 사용은 다른 선박 항공기보다 명확하게 시각하므로 우리는 얇은 혈관 섹션을 얻을 수 있습니다. 대신 작은 선박 세그먼트의 사용보다는 선박에 걸쳐 절단하면 내피 및 평활근 레이어 쉽게 볼의 장점이 있습니다. 또한, 확장 깊이 소프트웨어가 10-12 다른 선박 항공기의 명확한 이미지를 생산하고 공촛점 레이저 스캐닝 현미경의 사용보다 비용이 많이 드는와 디지털 immunofluorescent 현미경을 사용하지 않습니다.
Protocol
1. Pial 동맥의 분리 및 준비
- 생쥐가 anesthetized 삽입하고 1X PBS에 1% 에반스 블루와 동맥과 perfuse에 카테터를 확보하는 동안. Pial 선박 에반스 청색 색소 그들이 쉽게 분리하고 잘 얼룩.
- 필요한 ° C까지 -70의 두뇌와 매장의 압축을 풉니다. 최적 두뇌는 더 이상 이개월 이상 저장해서는 안됩니다.
- 해부 현미경을 사용하면 두뇌의 표면에서 pial arterioles (평균 직경 35-50 μm의)를 제거합니다. 조심스럽게 밀고 미세 집게를 사용하여 피질의 지느러미와 수평 표면에서 파란색 묻은 arterioles을 가져옵니다. 정착액에 배치하기 전에 자기편 초과하는 대뇌 피질의 조직을 제거합니다.
- 30 분 0.1M PBS에 2% 추위 paraformaldehyde에 수확 arterioles을 수정.
- sectioning에 대한 arterioles을 준비하기 위해서는 디스크 냉동 / 척 (-20 ° C에서 설정)에 포함 매체를 부어.
- 척 드러 장소 arteriole 섹션그것이 동결하는 ND 기다. 단단히를 직면하고있는 동맥의 끝과 미디어를 포함에 그라 이오 스탯 냉동 디스크에 마우스 오른쪽 배가 장소. 그것이 solidly 냉동 때까지 핀셋으로 잡아.
- 그라 이오 스탯의 머리에 선박과 냉동 디스크를 놓고 그라 이오 스탯 8 μm의 pial arteriole 고리를 잘라.
- 크롬 - 칼륨 - 젤라틴 subbed 슬라이드에 arteriole 섹션을 탑재합니다.
- 4 ° C에서 하룻밤 냉장고에 슬라이드 상자에 준비된 슬라이드를 저장합니다.
2. ER - α Immunofluorescent 얼룩
1 일
- 냉장고에서 슬라이드를 제거, 실내 온도 각을 가지고.
- 슬라이드를 세척하기 위해서는 1-1.5 ML 0.1M PBS가 (충분한 모든 섹션을 충당하기 위해), 10 분 동안 앉아 물기 두 번 더 절차를 반복하게 부어. 슬라이드의 각 가장자리는 소수성 마커 있습니다. 따라서 액체는 슬라이드의 표면에 남아 있습니다. 각각의 세척과 액체는 부어밖으로 신선한 0.1 M PBS로 교체.
- 내생 형광을 줄이기 위해 실온에서 30 분 50mM 암모늄 염화 1 ML에 슬라이드를 품어.
- 0.1M PBS 3x10 최소의 슬라이드를 씻으십시오. 로 2.2의 설명
- 0.1 % Triton은 - X 100 플러스 30 분 PBS에서 1퍼센트 정상 염소 혈청 (NGS)의 블록 슬라이드. 비 특정 바인딩을 줄일 수 있습니다.
- PBS에서 + 0.1 % Triton은 - X 4 박 + 1 % NGS ° C., 기본 항체 (1:500 토끼 polyclonal 반 ER - α)와 샘플을 품어
날 2
- 냉장고에서 슬라이드를 제거, 실내 온도 각을 가지고.
- 0.1M PBS 3x10 최소의 슬라이드를 씻으십시오. 로 2.2의 설명
- 1 % NGS 상온에서 어둠 속에서 2 시간 동안 0.1 % 트리톤 - X100 + PBS에서 오리건 그린 488 보조 안티 토끼로 품어. 이 단계에서 다음 단계가 어둠 속에서 할 수 있어야합니다.
- 0.1M PBS 3x10 최소의 슬라이드를 씻으십시오. 로 2.2의 설명
- 적에서ntilated 후드, 4 '대신 한 방울, 6 diamidino - 2 - phenylindole (DAPI) 플러스 다음 장착 혈관에 미디어와 예제를 통해 커버 전표를 놓습니다.
- 커버 슬립의 가장자리를 밀봉 매니큐어가 명확 손톱을 적용합니다. 약 24 시간 소요되는, 완전히 건조까지 슬라이드를 이동하지 마십시오.
3. 디지털 형광 이미징
- pial 선박의 이미징 ER - α는 우리가 디지털 카메라를 갖춘 3 색상 (청색, 녹색 및 빨간색)에 대한 필터와 니콘 이클립스 80i 디지털 형광 현미경을 사용하여 슬라이스에 대한.
- 현미경으로 스테인드 pial 선박 세그먼트로 준비된 슬라이드를 삽입하고 관심의 찬란 표시된 영역을 시각화하기 위해 조정할 수 있습니다. 다음 X600 배율로 증가 x100 확대 시작합니다.
- 여러보기를 변환하는 DAPI (파란색)과 세포 핵 (DAPI)과 니콘 확장 깊이 초점 소프트웨어를 사용하여 ER - α (오레곤 그린)에 대한 FITC (녹색) 채널에서 이미지를 캡처하는 카메라를 사용하여2 - D 이미지로 선박 세그먼트의.
4. 대표 결과 :
우리 지역화된 형광 프로브를 사용 pial 동맥 혈관에서 에스 트로겐 수용체 - α 및 디지털 형광 현미경을 사용하여 수용체 우리의 시각을 최적화. 수용체, 토끼 polyclonal 항체 주와 오리건주 그린 라벨 488 차 항체는 이미지 두뇌의 표면으로부터 격리 pial 동맥에있는 수용체를 사용한의 존재를 감지합니다. 또한, 핵 얼룩 (DAPI) 세포 핵을 파악하고 ER - α는 세포 cyotosol과 핵에 존재하는 것으로보고되었습니다 이후 우리가 핵에있는 수용체를 검색할 수 있는지 확인하기 위해 사용되었습니다. 또한, 우리는 기본 항체의 특이성을 확인하고 기본 항체에 대한 이차의 바인딩을 확인하기 위해 확실한 실험을 실시했다.
그림 1. Immunofluorescent ER - α에 대한 얼룩 (녹색)과 여성 쥐의 두뇌에서 격리 pial 동맥 링의 DAPI (파란색)와 counterstaining. 그림 1A 일부 intranuclear 에스 트로겐의 존재 제안 병합된 이미지 수용체를 (화살표).을 보여줍니다 무화과 1B와 1C는 Z - 스택 이미지의 조합입니다 ER - α의 초점을 맞춘 이미지입니다. 이미지 X600 확대 촬영하고 다른 항공기에서 동일한 선박의 절단 링 출신되었습니다. 화살표는 에스 트로겐 수용체 - α를 나타냅니다.
그림 2. 여성 쥐의 두뇌에서 격리 pial 동맥 고리의 컨트롤 그룹에 대한 Immunofluorescent 얼룩. 그림 2D는 일차 항체없이 혈관을 보여줍니다. 무화과 2E는 보조 항체 (내피 측면을 따라 주 뚜렷한 autofluorescence)없이 선박을 보여줍니다. 이미지 X600 확대 촬영과 differe에서 동일한 선박의 절단 링 출신되었습니다NT의 비행기.
Discussion
이전에, 우리는 일시적인 글로벌 허혈성 뇌 손상 후 vasodilators 7, 8, 9 vasoconstrictors 모두에 대응 직경을 변경할 수 pial 동맥 용량이 현저하게 젊은 ovariectomized 쥐에 우울증 증세가있다는 것을 보여주었다. 만성 에스 트로겐 충만은 vasomotor 응답 7-9을 복원합니다. 또한, 지연 에스 트로겐 대체 우리가 장기적인 에스 트로겐 고갈이 cerebrovasculature에서 ER - α 농도에 영향을 미치는 여부를 질문에 선도적인 pial 동맥 vasodilatory 용량 10 에스 트로겐의 유익한 효과를 반대. 우리는 서구가 만성 에스 트로겐 고갈에 대한 응답으로 ER - α 표현의 변화를 평가하기 위해 blotting과 함께 immunofluorescent 라벨을 사용하는 계획. 우리는 수용체의 개별 그룹의 시각화에서 일부 어려움을했기 때문에 우리가 여기 입증하는 방법을 수정했습니다. 따라서,이 연구에서 우리의 주요 목표는 먼저 영상을 최적화하기위한 비교적 간단한 방법을 개발하는 것이었다pial arterioles에서 수용체의 ization. 여러 보고서와 계약 6,11,12 우리는 그것이 필요한 우리가 탐색되었다 조직의 유형에 대한 조정, 샘플의 두께, 선박에서 ER - α의 분포뿐만 아니라, 비 특정 바인딩 정도를 만들기 위해 발견 .
우리의 방법은 pial 선박 조각에서 ER - α의 존재를 시각화하는 것은 매우 효과적입니다. 그러나 다른 사람들이 이전에 이러한 방법의 성공적인 사용을 지적대로하면 항체의 특이성과 농도,이자, 고정 및 차단 프로토콜 및 조직 처리 12 단백질의 subcellular 위치에 크게 의존합니다. 전에 우리 선박 준비 시각화하기 위해 우리 모두가이 변수를 해결하기 위해 시간을 보냈다. 우리는 본 논문에서 우리의 접근의 일부를 조정하는 데 필요한 방법을 강조했습니다.
우리는 최적 pial arterioles에서 ER - α를 시각화로 설정하고 이것은 몇 가지 과제를 제시했습니다.첫째, 쥐 pial 동맥의 평균 크기는 뇌 표면으로부터 격리 및 제거가 다소 까다롭습 만들기 35-50 μm의 사이에있다. 우리는 에반스 청색 색소 이전 희생하면 쉽게 동맥 절개를 만드는 가진 재관류를 발견했습니다. 에반의 청색 형광에 영향을 줄 수 있지만, 우리는이 염료를 사용하는 장점는 사소한 단점보다 중요한 생각합니다. 우리 프로토콜에는 혈관이 여러 번 씻어 있습니다. 이것은 혈관에 잔류 염료를 최소화하고 형광에있는 염료의 가능한 효과를 감소시킵니다. 우리가 발생한 또 다른 어려움은 pial 선박 세그먼트의 두께가 어려운 수용체의 명확한 시각화를 만든 것이었습니다. 또한, 우리는 ER - α는 여러 세포 레이어로 흩어졌다는 사실에 아마 때문에 특히 명확한 이미지를 얻을 수 없습니다. 우리는 세로 선박 조각 (다른가 등)와 함께 작업을했는데, 설치하는 동안 때문에 작은 pial 크기로 그것은 혈관을 처리하고 혈관의 비틀림 방지하기 어려웠습니다현미경을 사용하는 경우에도이 슬라이드. 마지막으로, 우리는 성공적으로 그라 이오 스탯을 사용하여 8 μm의 두께 고리에 상호 현명한 혈관을 절단하여 기술을 수정했습니다. 반지는 쉽게 처리할 수 있으며, 여러 가지 하나의 슬라이드에 장착할 수 있습니다.
일단 우리가 필요 Danseshatalb와 동료 11 제안으로 혈관을 고정 후 조직을 냉동 첫번째 플래시의 효과를 테스트하는 느낌이 혈관을 취득하였습니다. 우리가 marginally 덜 배경 immunofluorescence을 찾았지만, 우리는 또한 수용체가 적은 강하게 수용체의 시각화가 더 어렵게 스테인드 있다고 지적했다. 따라서, 우리는 (일반적으로 사이 1~2개월) 필요한까지 전체 두뇌를 동결하고 저장하기 위해 먼저 선호합니다. 우리는 다음과 같은 설명 혈관을 해내하고 그라 이오 스탯과 함께 깔끔히하기 전에 혈관을 수정. 여기서 보여주는대로.
한 필요한 단계는 기본 및 별도 보조 항체 모두 컨트롤을 실행하는 것입니다특이성과 배경 immunofluorescence을 결정합니다. 에스 트로겐 수용체 - α 항체는 작동하기 어려울 수 있습니다. 우리가 우리의 수용체 얼룩의 성공에 만족하기 전에 그 사실, 우리는 3 개의 기본 항체 (1 단클론 2 polyclonal) 했어요. 우리 컨트롤의 일환으로 우리는 먼저 기본 항체의 추가 태만에 의해 기본 항체의 특이성을 확인. 그림 2D는 일차 항체없이 혈관을 보여줍니다. 어떤 얼룩과 조금은 배경 신호가 없습니다. 기본 항체는 polyclonal이기 때문에, 몇몇 확산이 아닌 구체적인 배경 얼룩이 있습니다. 둘째, 우리는 기본 항체를 추가,하지만 보조 항체 (그림의 2E). 하나는 혈관의 내피 국경을 따라 autofluoresence를 나타내는 좋은 마진을 볼 수 있습니다. 이것은 단과 동료 5 작품과 일치합니다. 그러나, ER - α를 대표 immunofluorescence의 작은 지점이나 세분화된 모양의 심판이도수많은 수용체의 존재를 lecting하는 것은 기본 및 보조 항체 모두의 조합없이도 감지가 가능하다. 우리는 혈관의 내피 여백 따라 autofluoresence의 별개의 패턴을 지적했다. 그들은 ER - α에 대한 항체의 특이성을 확인하고 보조 항체가 기본에 바인딩으로 항체 특이성에 대한 이러한 독립적인 테스트는 중요합니다.
결론적으로, 타인에 의해 증명 4, 5 뇌 혈관이 많은 ER - α 수용체 서브 타입이 포함되어 있습니다. 우리 손 안에 고립되어 pial 동맥에서 8μm 교차 단면 조각을 준비하는 것이 얼룩과 수용체의 시각화을 향상시킵니다. 전통적인 방법은 샘플을 검토 공촛점 현미경을 사용합니다. 두꺼운 표본에서 직렬 광학 부분을 볼 수있는 능력을 갖는 것은 공촛점 현미경의 중요한 장점이다. 그러나, 좋은 공촛점 현미경의 구입은 매우 비쌀 수 있습니다. 확장 깊이 (EDF) 소프트웨어를 사용함으로써, 우리는 사실을 발견우리의 장비 비용을 줄일 수 있습니다. EDF와 형광 현미경을 사용하여 우리는 명확한 이미지를 획득하고 Z - 스택을 사용하여 여러 수준에서 pial 동맥 ER - α를 시각화 할 수 있습니다. EDF 소프트웨어의 큰 장점은 그것이 효과적으로 이미지에서 3 차원 사진을 만드는 방식으로 이미지 캡처를 허용한다는 것입니다. 공촛점 현미경이나 자금을 하나 만들어 appropriated 소프트웨어로 디지털 형광 현미경을 구입할에 액세스할 수 없습니다 연구소에 대한 조사의 목적에 따라 실용적이고 적은 비용 옵션이있을 수 있습니다.
Disclosures
관점은 저자의 견해이며, 건강 과학의 제복 차림의 서비스 대학, 국방부, 또는 미국 정부의 공식적인 정책이나 입장을 반영하지 않습니다.
Acknowledgments
이 프로젝트에 대한 작업은 건강 R01 - NR5339의 국립 연구소에서 보조금 및 보건 과학 - R061LD의 군복을 입은 서비스 대학에 의해 지원되었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| EVANS BLUE | Sigma-Aldrich | E-2129 | |
| PBS 10X | Sigma-Aldrich | P-5493 | |
| Paraformaldehyde | Fisher Scientific | T353 | |
| Tissue-Tek O.C.T Compound | VWR international | 25608-930 | |
| Ammonium chloride | Sigma-Aldrich | A9434 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T9284 | |
| Normal Goat Serum | Invitrogen | 16210-064 | |
| ER-α rabbit polyclonal antibody | Santa Cruz Biotechnology, Inc. | H-184 | |
| Oregon green 488 goat anti rabbit IgG | Invitrogen | O-11038 | |
| Vectashield mounting medium for fluorescence with DAPI | Vector Laboratories | H-1200 |
References
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