Summary
El objetivo de este artículo es mostrar un método para optimizar la detección de inmunofluorescencia de los receptores de estrógenos-α (ERα) en ratas pial rebanadas arterial usando un microscopio de inmunofluorescencia digital.
Abstract
Muchos de los efectos del estrógeno sobre la reactividad vascular están mediados por la interacción con receptores de estrógenos 1, 2, 3. A pesar de dos sub-tipos existen (los receptores de estrógenos-α y β), los receptores de estrógenos-α ha sido identificado tanto en el músculo liso y células endoteliales de pial segmentos arteriales mediante la tinción fluorescente combinado con láser confocal de barrido microscopio 4. Por otra parte, ER-α se encuentra en el núcleo y en el citoplasma de las arterias basilar ratas 5. Los receptores son abundantes y fluorescentes brillantes, pero la visualización clara de los grupos discretos de receptores es difícil debido probablemente a los números situados en las capas de células que muchos de los segmentos de buques pial. Además, muchos informes mediante técnicas de inmunohistoquímica se combina con microscopía confocal mal detalle los requisitos críticos para la reproducción de los experimentos 6. Nuestro propósito en este artículo es describir una técnica sencilla para optimizar el tque las manchas y la visualización de ER-α utilizando secciones transversales de las arteriolas pial obtener de los cerebros de ratas hembras. En primer lugar, perfundir las ratas con colorante azul de Evans para identificar con facilidad las arterias superficie pial que se aísla en un microscopio de disección. El uso de un criostato para cortar secciones de 8 micras cruz de las arterias que nos permite obtener cortes finos vasos para que los aviones de diferentes vasos están más claramente visualizada. Atravesando el buque en lugar de utilizar un segmento de vaso pequeño tiene la ventaja de facilitar la visualización de las capas endoteliales y de músculo liso. Además, el uso de un microscopio de inmunofluorescencia digitales con el software de gran profundidad produce imágenes claras y de diez a doce aviones barco diferente y es menos costosa que el uso de un microscopio láser confocal de barrido.
Protocol
1. Aislamiento y preparación de las arterias Pial
- Mientras que la rata es insertar anestesiados y seguro de un catéter en una arteria y una perfusión con Evans 1% de azul en 1X PBS. Vasos piales mancha bien con el colorante azul de Evans haciéndolos más fáciles de aislar.
- Extraer el cerebro y se almacena a -70 ° C hasta que sea necesario. De manera óptima, el cerebro no se deben almacenar más de 2 meses.
- Utilizando un microscopio de disección eliminar las arteriolas pial (35-50 micras de diámetro promedio) de la superficie del cerebro. Extraiga cuidadosamente todas las arteriolas teñidas de azul de dorsales y laterales de la superficie de la corteza usando pinzas de punta fina. Eliminar el exceso de tejido cortical adheridas antes de colocar en el fijador.
- Fijar las arteriolas cosechado en el 2% de paraformaldehído frío en PBS 0,1 M durante 30 min.
- Para preparar las arteriolas para seccionar vierta medio de inclusión en la congelación de disco / plato (fijada en -20 ° C).
- Coloque la sección arteriola plana sobre el plato unaº esperar a que se congele. Firmemente a cabo el buque arriba a la derecha en el disco de la congelación sobre la incorporación de los medios de comunicación criostato con la punta de la arteria hacia usted. Sostenerlo con pinzas hasta que esté sólidamente congelado.
- Coloque el disco de congelación con el vaso en la cabeza del criostato y cortar ocho anillos micras pial arteriola con el criostato.
- Monte las secciones de las arteriolas de cromo y potasio de gelatina diapositivas subbed.
- Tienda de las diapositivas preparadas en una caja de diapositivas en el refrigerador a 4 º C durante la noche.
2. ER-α tinción de inmunofluorescencia
Día 1
- Eliminar las diapositivas de la nevera, poner cada uno a temperatura ambiente.
- Para este lavado verter 1-1,5 ml 0,1 M PBS (suficiente para cubrir todas las secciones) deje reposar durante 10 minutos, escurrir y repetir el procedimiento dos veces más. Cada borde de la diapositiva tiene un marcador hidrofóbicas. En consecuencia, el líquido permanece en la superficie de la diapositiva. Con cada lavado se vierte el líquidoy reemplazados con PBS 0,1 M.
- Incubar los portaobjetos en 1 ml de cloruro de amonio 50 mM durante 30 min a temperatura ambiente para reducir la fluorescencia endógena.
- Se lavan los portas en PBS 0,1 M 3x10 min. como se describe en el punto 2.2
- Diapositivas de bloque en el 0,1% Triton X-100, más 1% de suero normal de cabra (NGS) en PBS durante 30 min. para reducir la unión no específica.
- Incubar las muestras con el anticuerpo primario (policlonal de conejo anti-ER-α, 1:500) en PBS + 0,1% Triton X-NGS + 1% de la noche a 4 ° C.
Día 2
- Eliminar las diapositivas de la nevera, poner cada uno a temperatura ambiente.
- Se lavan los portas en PBS 0,1 M 3x10 min. como se describe en el punto 2.2
- Incubar con Oregon Green 488 secundario anti-conejo de NGS 1% 0,1% Triton-X100 + PBS durante 2 horas en la oscuridad a temperatura ambiente. A partir de este paso, los siguientes pasos deben hacerse en la oscuridad.
- Se lavan los portas en PBS 0,1 M 3x10 min. como se describe en el punto 2.2
- En virtud de un vecampana ntilated, coloque 1 gota de 4 ', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI), además de medio de montaje en los vasos y colocar un cubreobjetos sobre la muestra.
- Aplicar esmalte de uñas transparente para sellar los bordes de la hoja de cubierta. No mover las diapositivas hasta que esté completamente seca, que dura aproximadamente 24 horas.
3. Fluorescencia de imagen digital
- Para obtener imágenes de ER-α en el vaso pial corte se utiliza una Nikon Eclipse 80i microscopio digital fluorescente con filtros de tres colores (azul, verde y rojo), equipado con una cámara digital.
- Inserte las diapositivas preparadas con los segmentos de buques manchada pial bajo el microscopio y ajuste para visualizar las áreas de interés marcados con fluorescencia. Iniciar con un aumento de x100 luego aumentar a x600 aumentos.
- Utilice la cámara para capturar imágenes en DAPI (azul) y FITC (verde) para los canales de los núcleos celulares (DAPI) y ER-α (Oregon Green), utilizando el software Nikon extendido foco de profundidad para convertir ver múltipless de los segmentos de buques en imágenes 2-D.
4. Los resultados representativos:
Estamos localizados los receptores de estrógenos-α en el pial vasos arteriales mediante sondas fluorescentes y optimizado nuestra visualización del receptor mediante microscopía de fluorescencia digital. Para detectar la presencia del receptor, un conejo anticuerpo primario policlonal y un verde Oregon 488 anticuerpo secundario marcado se utilizó la imagen de los receptores en las arterias pial aislada de la superficie del cerebro. Además, una tinción nuclear (DAPI) se utilizó para identificar los núcleos de las células y determinar si se podría detectar receptores localizados en el núcleo desde el ER-α se ha informado que estará presente en el cyotosol célula y el núcleo. Además, se realizaron experimentos de confirmación para validar la especificidad del anticuerpo primario y para verificar la unión de la secundaria a la primaria de anticuerpos.
Figura 1. Tinción de inmunofluorescencia para la ER-α (verde) y contratinción con DAPI (azul) en un anillo arterial pial aislada de cerebro de rata hembra. Fig. 1A muestra las imágenes fusionadas lo que sugiere la presencia de cierta cantidad de estrógenos intranucleares receptor-a. (Flecha) Fig. 1B y 1C son la imagen enfocada de ER-α, que es una combinación de Z-stack imágenes. Las imágenes fueron tomadas en x600 magnificación y son del anillo de corte de la misma nave en diferentes planos. Las flechas indican los receptores de estrógenos-α.
Figura 2. Tinción de inmunofluorescencia para los grupos de control en una red de arterias pial aislada de cerebro de rata hembra. Fig. 2D muestra el buque sin anticuerpo primario. Fig. 2E muestra el buque sin el anticuerpo secundario (autofluorescencia nota distinta al lado endotelial). Las imágenes fueron tomadas en x600 magnificación y son del anillo de corte de la misma nave en diferent aviones.
Discussion
Anteriormente, hemos demostrado que después de una lesión transitoria mundial cerebral isquémico de la arteria pial capacidad de cambio de diámetro en respuesta a los vasodilatadores 7, 8 y 9 vasoconstrictores es marcadamente deprimidos en los jóvenes ratas ovariectomizadas. Reposición de estrógeno crónica restaura las respuestas vasomotoras 7-9. Además, el reemplazo de estrógeno retraso revierte los efectos beneficiosos de los estrógenos sobre la arteria pial capacidad vasodilatadora 10 que nos lleva a la pregunta de si a largo plazo el agotamiento de los estrógenos afecta a ER-α densidad en el cerebrovasculature. Se planificó utilizar el etiquetado de inmunofluorescencia en combinación con el Western Blot para evaluar los cambios en la ER-α expresión en respuesta al agotamiento del estrógeno crónica. Porque hemos tenido algunas dificultades en la visualización de los grupos discretos de receptores se modificó el método que se demuestra aquí. Por lo tanto, nuestro objetivo principal en este estudio fue desarrollar primero un método relativamente sencillo para optimizar la visualzación de los receptores en las arteriolas pial. De acuerdo con varios informes 6,11,12 nos pareció que era necesario hacer ajustes para el tipo de tejido que estaban investigando, el espesor de la muestra, la distribución de ER-α en el buque, así como el grado de unión no específica .
Nuestro método es muy eficaz para visualizar la presencia de ER-α en rodajas barco pial. Sin embargo, como ya se ha señalado anteriormente el uso exitoso de estos métodos depende en gran medida la especificidad y la concentración de los anticuerpos, la localización subcelular de las proteínas de interés, la fijación y protocolos de bloqueo y la manipulación de tejidos 12. Antes de la visualización de los preparativos nuestro barco pasamos tiempo para trabajar en todas estas variables. Hemos puesto de relieve la forma en que es necesario ajustar algunos de nuestro enfoque en este documento.
Nos pusimos en marcha para visualizar de forma óptima ER-α en las arteriolas piales y esto presenta algunos desafíos.En primer lugar, el tamaño promedio de una arteria de rata pial es entre 35 a 50 micras haciendo aislamiento y la eliminación de la superficie del cerebro un poco complicado. Encontramos que la perfusión con colorante azul de Evans antes de su sacrificio hace la disección de las arterias más fácil. Azul de Evans pueden afectar a la fluorescencia, pero creemos que la ventaja de utilizar este medio son mayores que sus inconvenientes menores. En nuestro protocolo de los vasos se lavan varias veces. Esto minimiza el tinte residual en los vasos sanguíneos y reduce los posibles efectos del colorante en la fluorescencia. Otra dificultad que encontramos fue que el espesor de los segmentos de buques pial hizo una visualización clara de los receptores difícil. Además, no hemos podido obtener imágenes muy clara, probablemente debido al hecho de que la ER-α se dispersó a lo largo de varias capas de células. Hemos intentado trabajar con las rebanadas de vasos longitudinales (como otros han hecho), pero debido al tamaño pequeño pial era difícil de manejar las embarcaciones y evitar la tortuosidad de los vasos durante el montajeen las diapositivas, incluso con un microscopio. Por último, hemos modificado nuestra técnica con éxito mediante el uso de un criostato y cortar el buque en sentido cruzado a ocho anillos de micras de espesor. Los anillos son más fáciles de manejar y varios se puede montar en una diapositiva.
Una vez que hemos adquirido los vasos creemos que es necesario poner a prueba la eficacia de la primer destello de la congelación de los tejidos a continuación se fijan los vasos según lo sugerido por Danseshatalb y asociados 11. A pesar de que encontró un poco menos de inmunofluorescencia de fondo, también señaló que los receptores manchada con menor intensidad lo que la visualización de los receptores más difícil. En consecuencia, preferimos primero en congelar todo el cerebro y la tienda hasta que sea necesario (generalmente entre 1-2 meses). A continuación, salga de los vasos como se describe y arreglar los barcos antes de cortar con el criostato. como se demuestra aquí.
Un paso necesario es para ejecutar los controles tanto con la primaria y la secundaria de anticuerpos por separadopara determinar la especificidad y la inmunofluorescencia de fondo. El estrógeno α del receptor de anticuerpos pueden ser difíciles de trabajar. De hecho, hemos tratado tres diferentes anticuerpos primarios (1 monoclonales y policlonales 2) antes de que se mostraron satisfechos con el éxito de nuestra tinción de los receptores. Como parte de nuestros controles, primero verificar la especificidad del anticuerpo primario por omisión de la adición del anticuerpo primario. La figura 2D muestra el buque sin anticuerpo primario. No hay manchas y sólo una señal de poco fondo. Puesto que el anticuerpo primario es policlonal, hay una cierta difusa tinción no específica de fondo. En segundo lugar, añadió el anticuerpo primario, pero no el anticuerpo secundario (Fig. 2E). Se puede ver un buen margen en representación de la autofluoresence a lo largo de las fronteras del endotelio de los vasos. Esto es consistente con la obra de Dan y sus asociados 5. Sin embargo, ni los pequeños puntos de inmunofluorescencia que representan ER-α, ni el árbitro aspecto granularlecting la presencia de numerosos receptores pueden ser detectadas sin la combinación de los anticuerpos primarios y secundarios. Hemos observado un patrón distinto de autofluoresence a lo largo de los márgenes del endotelio de los vasos. Estas pruebas independientes de la especificidad de anticuerpos son importantes ya que confirman la especificidad de los anticuerpos de ER-α y el anticuerpo secundario se une a la primaria.
En conclusión, como lo demuestran los otros 4, 5 vasos sanguíneos del cerebro contienen numerosos ER-α sub-tipo de receptores. En nuestras manos, preparando 8μm rebanadas de la sección transversal de las arterias aisladas pial mejora la coloración y la visualización de los receptores. Los métodos tradicionales de uso de la microscopía confocal para estudiar las muestras. Tener la capacidad para ver la serie de secciones ópticas a partir de muestras de espesor es un beneficio importante de la microscopía confocal. Sin embargo, la compra de un microscopio confocal bien puede ser muy costoso. Mediante el uso de gran profundidad (FED) de software, se encontró quepodría reducir nuestros costos de los equipos. Utilizando un microscopio de fluorescencia con EDF se obtuvieron imágenes claras y son capaces de visualizar pial arterial ER-α en varios niveles con Z-pilas. Una ventaja importante de los programas del FED es que permite la captura de imágenes de una manera efectiva para crear una imagen 3-D a partir de las imágenes. Para los laboratorios que no tienen acceso a un microscopio confocal o los fondos para una compra de un microscopio digital fluorescente con el software apropiado puede ser una opción práctica y menos costosa en función de los objetivos del investigador.
Disclosures
Las opiniones expresadas son las de los autores y no reflejan la política oficial ni la posición de la Universidad de Servicios Uniformados de Ciencias de la Salud, el Departamento de Defensa, o el gobierno de Estados Unidos.
Acknowledgments
El trabajo para este proyecto fue apoyado por becas de los Institutos Nacionales de Salud R01-NR5339 y la Universidad de Servicios Uniformados de Ciencias de la Salud-R061LD.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| EVANS BLUE | Sigma-Aldrich | E-2129 | |
| PBS 10X | Sigma-Aldrich | P-5493 | |
| Paraformaldehyde | Fisher Scientific | T353 | |
| Tissue-Tek O.C.T Compound | VWR international | 25608-930 | |
| Ammonium chloride | Sigma-Aldrich | A9434 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T9284 | |
| Normal Goat Serum | Invitrogen | 16210-064 | |
| ER-α rabbit polyclonal antibody | Santa Cruz Biotechnology, Inc. | H-184 | |
| Oregon green 488 goat anti rabbit IgG | Invitrogen | O-11038 | |
| Vectashield mounting medium for fluorescence with DAPI | Vector Laboratories | H-1200 |
References
- Smiley, D. A., Khalil, R. A. Estrogen compounds, estrogen receptors and vascular cell signaling in the aging blood vessels. Curr. Med. Chem. 16, 1863-1887 (2009).
- Miller, V. M., Duckles, S. P. Vascular actions of estrogens: functional implications. Pharmacol. Rev. 60, 210-241 (2008).
- Duckles, S. P., Krause, D. N. Cerebrovascular effects of oestrogen: multiplicity of action. Clin. Exp. Parmacol. Physiol. 34, 801-808 (2007).
- Stirone, C., Duckles, S. P., Krause, D. N. Multiple forms of estrogen receptor-a incerebral blood vessels: regulation by estrogen. Am. J. Physiol. Endocrinol. Metab. 284, E184-E192 (2003).
- Dan, P., Cheung, J. C., Scriven, D. R., Moore, E. D. Epitope-dependent localization of estrogen receptor-alpha, but not -beta, in en face arterial endothelium. Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 284, 1295-1306 (2003).
- Fritschy, J. M. Is my antibody staining specific? How to deal with pitfalls of immunohistochemistry. Eur. J. Neurosci. 28, 2365-2370 (2008).
- Watanabe, Y., Littleton-Kearney, M. T., Traystman, R. J., Hurn, P. D. Estrogen restores post-ischemic pial and microvascular dilation. Am. J. Physiol. Heart and Circ. 281, H155-H160 (2001).
- Li, M., Zeynalov, E., Li, X., Miyazaki, C., Koehler, R. C., Littleton-Kearney, M. T. Effects of estrogen on postischemic pial artery reactivity to ADP. Microcirculation. 16, 403-413 (2009).
- Qin, X. Y., Hurn, P. D., Littleton-Kearney, M. T. Estrogen restores postischemic sensitivity to thromboxane mimetic U46619 in rat pial artery. Cereb. Blood. Flow. Metab. 25, 1041-1046 (2005).
- Miyazaki, C., Koelher, R. C., Littleton-Kearney, M. T. Effects of HET0016 and estrogen on pial artery vasodilatory capacity. FASEBJ Abstracts. , (2007).
- Daneshtalab, N., Dore, J. J. E., Smeda, J. S. Troubleshooting tissue specificity and antibody selection: procedures in immunohistochemical studies. J. Pharmacol. Toxical. Methods. 61, 127-135 (2010).
- Lorincz, A., Nusser, Z.
