Summary
Målet med denne artikel er at vise en metode til at optimere immunofluorescent påvisning af østrogen-receptor-α (ERα) i rotte pial arterielle skiver ved hjælp af en digital immunofluorescent mikroskop.
Abstract
Mange af østrogen har indvirkning på vaskulære reaktivitet er medieret gennem interaktion med østrogen receptorer 1, 2, 3. Selvom to sub-typer, der findes (østrogen receptor-α og β), er østrogen-receptor-α blevet identificeret i både den glatte muskulatur og i endotelceller af pial arterielle segmenter ved hjælp fluorescensfarvede kombineret med konfokal laser scanning mikroskopi 4. Desuden er ER-α placeret i kerner og i cytoplasma af rotte basilaris arterier 5. Receptorerne er rigelige og fluorescerer dejligt, men klar visualisering af diskrete grupper af receptorer er vanskelig sandsynligt på grund af numrene ligger i mange cellelag i pial skibssegmenter. Derudover er der mange rapporter ved hjælp af immunhistokemiske teknikker parret med konfokal mikroskopi dårligt detaljer kravene kritisk for reproduktion af eksperimenter 6. Vores formål med denne artikel er at beskrive en simpel teknik til at optimere than farvning og visualisering af ER-α ved hjælp af tværgående skiver af pial arterioler indhente fra kvindelige rotte hjerner. Vi først perfuse rotter med Evans blå farvestof til nemt at identificere overfladen pial arterierne, som vi isolerer under et dissektionsmikroskop. Brug af et kryostat at skære 8 μm tværsnit af arterierne giver os mulighed for at få tynd fartøj sektioner, således at forskellige fartøj planer er mere tydeligt visualiseres. På tværs skibet frem for at bruge et lille fartøj segment har den fordel, lettere visning af endotel og glatte muskulatur lag. Hertil kommer, brug af en digital immunofluorescent mikroskop med udvidet dybde software giver klare billeder af 10-12 forskellige fartøj fly og er mindre omkostningskrævende end brugen af en konfokal laser scanning mikroskop.
Protocol
1. Isolering og Udarbejdelse af Pial arterier
- Mens rotten er bedøvet indsætte og sikre et kateter i en arterie og perfuse med 1% Evans blå i 1X PBS. Pial skibe pletten godt med Evans blå farve gør dem lettere at isolere.
- Uddrag hjernen og opbevares ved -70 ° C indtil de skal bruges. Optimalt bør hjerner opbevares længere end 2 måneder.
- Ved hjælp af en dissektionsmikroskop fjerne pial arterioler (gennemsnitlig diameter på 35-50 μm) fra overfladen af hjernen. Træk forsigtigt alle de blå-farvede arterioler fra ryggen og lateral overfladen af cortex med fin spids tang. Fjern overskydende omliggende kortikale væv, før det kommes i fiksativ.
- Fix det høstede arteriolerne i 2% koldt paraformaldehyd i 0,1 M PBS i 30 min.
- For at forberede arteriolerne for sektionering hæld indlejre medium om indefrysning disk / Chuck (fastsat til -20 ° C).
- Placer arteriole afsnittet fladt på borepatron ennd vente til det at fryse. Fast sted skibet op til højre på kryostat nedfrysning disken på indlejring medier med spidsen af arterien mod dig. Hold det med pincet, indtil det solidt er frosset.
- Placer frysning disken med skibet ind i kryostat hovedet og skære 8 μm pial arteriole ringe med kryostat.
- Monter arteriole afsnittene om krom-kalium-gelatine Indskiftet dias.
- Opbevar den forberedte dias i et dias kasse i køleskab ved 4 ° C natten over.
2. ER-α Immunofluorescent Farvning
Dag 1
- Fjern slides ud af køleskabet, bringer hver til stuetemperatur.
- At vaske dias hæld 1-1,5 ml 0,1 M PBS (nok til at dække alle sektioner) Lad sidde i 10 minutter, hæld vandet fra og gentag proceduren to gange mere. Hver kanten af slide har en hydrofobisk markør. Derfor væsken forbliver på overfladen af diaset. Med hver vask væsken hældesud og erstattes med frisk 0,1 M PBS.
- Inkuber objektglassene i 1 ml af 50mM ammoniumchlorid i 30 min ved stuetemperatur for at mindske endogene fluorescens.
- Vask dias i 0,1 M PBS 3x10 min. som beskrevet i 2.2
- Block dias i 0,1% Triton-X 100 plus 1% normal ged serum (NGS) i PBS i 30 min. at reducere uspecifik binding.
- Inkubér prøver med det primære antistof (kanin polyklonalt anti-ER-α, 1:500) i PBS + 0,1% Triton-X + 1% NGS natten over ved 4 ° C.
Dag 2
- Fjern slides ud af køleskabet, bringer hver til stuetemperatur.
- Vask dias i 0,1 M PBS 3x10 min. som beskrevet i 2.2
- Inkuber med Oregon Green 488 sekundært anti-kanin i 1% NGS +0,1% Triton-X100 + PBS for 2 time i mørke ved stuetemperatur. Fra dette trin skal de næste skridt skal gøres i mørke.
- Vask dias i 0,1 M PBS 3x10 min. som beskrevet i 2.2
- Under en ventilated hætte, sted 1 dråbe 4 ', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) plus montering medier på skibe og derefter placere et dække glide over prøven.
- Anvende klare neglelak til at forsegle kanten af dækslet slip. Flyt ikke slides indtil den er helt tør, hvilket tager cirka 24 timer.
3. Digital Fluorescens Imaging
- For billedbehandlingsudstyr ER-α i pial skibet skive vi bruger et Nikon Eclipse 80i digitale fluorescerende mikroskop med filtre i 3 farver (blå, grøn og rød) er udstyret med et digitalt kamera.
- Sæt den klargjorte dias med farvede pial skibssegmenter under lup og tilpasse sig visualisere fluorescens-mærkede områder af interesse. Start med x100 forstørrelse derefter stige til X600 forstørrelse.
- Brug kameraet til at tage billeder i DAPI (blå) og FITC (grøn) kanaler til cellekerner (DAPI) og ER-α (Oregon Green) ved hjælp af Nikon Extended Dybde Fokus software til at konvertere flervisningss fartøj segmenter i 2-D billeder.
4. Repræsentative resultater:
Vi lokaliserede østrogen receptor-α i pial blodkar med fluorescerende prober og optimeret vores visualisering af receptoren ved hjælp af digital fluorescens mikroskopi. At påvise tilstedeværelsen af receptoren, en kanin polyklonale primære antistof og en Oregon Green 488 mærket sekundært antistof blev brugt til billede receptorerne i pial arterier isoleret fra overfladen af hjernen. Også en nuklear farvning (DAPI) blev brugt til at identificere de cellekerner, og afgøre, om vi kunne detektere receptorer placeret i kernen siden ER-α er blevet rapporteret til at være til stede i cellen cyotosol og kernen. Derudover gennemførte vi genfremsætte eksperimenter til validering specificiteten af det primære antistof og verificere binding af den sekundære til det primære antistof.
Figur 1. Immunofluorescent farvning for ER-α (grøn) og kontrastfarvning med DAPI (blå) i en pial arterie ring isoleret fra hunrotte hjernen. Figur 1A viser de fusionerede billederne tyder på tilstedeværelsen af nogle intranuclear østrogen-receptor-a (pil). Fig 1B og 1C er fokuseret billede af ER-α, som er en kombination af Z-stak billeder. Billeder blev taget på x600 forstørrelse og er fra skæres ring af det samme skib i forskellige planer. Pilene indikerer østrogen receptor-α.
Figur 2. Immunofluorescent farvning for kontrolgrupper i en pial arterie ring isoleret fra hunrotte hjernen. Figur 2D viser fartøjet uden primær antistof. Figur 2E viser fartøj uden det sekundære antistof (bemærk forskellige autofluorescens langs endotelial side). Billeder blev taget på x600 forstørrelse og er fra skæres ring af det samme skib i Forskelnt fly.
Discussion
Tidligere viste vi, at efter forbigående global iskæmisk hjerneskade de pial arterie evne til at ændre diameter som reaktion på begge vasodilatorer 7, 8 og vasokonstriktorer 9 er markant deprimeret hos unge ovariectomized rotter. Kronisk østrogen Mætning genskaber vasomotoriske reaktioner 7-9. Desuden forsinkede østrogen vender de gavnlige virkninger af østrogen på pial pulsåre vasodilaterende kapacitet 10 fører os til spørgsmålet om, hvorvidt langsigtede østrogen nedbrydning påvirker ER-α tæthed i cerebrovasculature. Vi har planlagt at bruge immunofluorescent mærkning kombineret med western blotting til at vurdere ændringer i ER-α udtryk i reaktion på kronisk østrogen udtynding. Fordi vi havde nogle problemer med visualisering af diskrete grupper af receptorer vi ændrede den metode, som vi viser her. Derfor er vores primære mål i denne undersøgelse var først at udvikle en relativ simpel metode til at optimere den visuelleization af receptorer i pial arterioler. Efter aftale med flere rapporter, 6,11,12 vi fandt det nødvendigt at foretage justeringer for den type væv vi var sondering, prøve tykkelse, fordelingen af ER-α i skibet, samt graden af ikke-specifik binding .
Vores metode er meget effektiv til at visualisere tilstedeværelsen af ER-α i pial fartøj skiver. Men som andre tidligere har påpeget den vellykkede brug af disse metoder er meget afhængig af specificitet og koncentrationer af antistoffer, subcellulære placering af proteiner af interesse, fiksering og blokering protokoller og væv håndtering 12. Forud for visualisering af vores fartøj præparater brugte vi tid til at finde ud af alle disse variabler. Vi har fremhævet, hvordan vi havde brug for at justere nogle af vores tilgang i dette papir.
Vi satte ud for at optimalt visualisere ER-α i pial arterioler og dette præsenteres et par udfordringer.Først, den gennemsnitlige størrelse af en rotte pial arterie er mellem 35-50 μm gør isolation og fjernelse fra hjernen overfladen lidt tricky. Vi fandt, at perfusion med Evans blå farvestof forud for ofre gør dissektion af arterierne lettere. Evan er blå kan påvirke fluorescens, men vi føler, at fordelen ved at bruge denne farve opvejer dets mindre ulemper. I vores protokol skibene er vasket flere gange. Dette minimerer den resterende farvestof i karrene og reducerer de mulige virkninger af farvestoffet på fluorescens. Et andet problem vi mødte var, at tykkelsen af pial skibssegmenter gjort det klart, visualisering af receptorer vanskelig. Derudover kunne vi ikke skaffe særligt tydelige billeder skyldes formentlig det faktum, at ER-α blev spredt rundt flere cellelag. Vi forsøgte at arbejde med langsgående fartøj skiver (som andre har), men på grund af de små pial størrelse var det vanskeligt at håndtere de fartøjer og forhindre vrid i skibe, mens monteringpå lysbilleder selv ved hjælp af et mikroskop. Endelig har vi med succes ændret vores teknik ved hjælp af en kryostat og mindsker skibets tværs kloge i til 8 μm tykke ringe. Ringene er nemmere at håndtere, og flere kan monteres på et dias.
Når vi købte de skibe, vi følte det nødvendigt at teste effektiviteten af første flash fryse vævet så om fastsættelse af fartøjer som foreslået af Danseshatalb og associerede virksomheder 11. Selv om vi fandt en anelse mindre baggrund immunfluorescens, vi bemærkede også, at de receptorer farvede mindre intenst gøre visualisering af receptorer vanskeligere. Derfor foretrækker vi først at fryse hele hjernen og gemme indtil de skal bruges (normalt mellem 1-2 måneder). Vi så pull off skibene, som beskrevet og løse de fartøjer, før udskæring med kryostat. som vi viser her.
Et nødvendigt skridt er at køre kontrol med både den primære og den sekundære antistof særskilttil at bestemme specificitet og baggrund immunofluorescens. Østrogen receptor-α-antistoffer kan være svært at arbejde med. Faktisk forsøgte vi 3 forskellige primære antistoffer (1 monoklonale og 2 polyklonalt), før vi var tilfredse med den succes, vores receptor farvning. Som en del af vores kontrol, vi først undersøgt specificiteten af det primære antistof ved undladelse af tilsætning af det primære antistof. Figur 2D viser fartøjet uden primær antistof. Der er ingen pletter og lidt baggrund signal. Da den primære antistof er polyklonale, der er en vis diffus non-specifik baggrund farvning. For det andet, vi tilføjet det primære antistof, men ikke det sekundære antistof (fig. 2E). Man kan se en pæn margen repræsenterer autofluoresence langs endotel grænser fartøjer. Dette er i overensstemmelse med det arbejde, som Dan og associerede virksomheder 5. Men hverken de små punkter i immunfluorescens, der repræsenterer ER-α, eller kornet udseende reflecting tilstedeværelsen af mange receptorer kan opdages uden en kombination af både den primære og sekundære antistoffer. Vi bemærkede et klart mønster med autofluoresence langs endotel udkanten af fartøjer. Disse uafhængige tests for antistoffer specificitet er vigtige som de bekræfter specificiteten af antistoffet til ER-α og den sekundære antistof binder sig til den primære.
Som konklusion, som det fremgår af andre 4 5 hjernens blodkar indeholder mange ER-α sub-type receptorer. I vores hænder, øger forberede 8μm tværsnitsareal skiver fra isolerede pial arterier farvning og visualisering af receptorer. Traditionelle metoder bruger konfokal mikroskopi til at undersøge prøver. Har kapacitet til at se seriel optisk sektioner fra tykke prøver er en vigtig fordel ved konfokal mikroskopi. Dog kan købe en god konfokal mikroskop blive meget dyrt. Ved at bruge Extended Dybde (EDF) software, fandt vi, atkunne reducere vores udgifter til udstyr. Ved hjælp af en fluorescerende mikroskop med EDF vi fået klare billeder, og er i stand til at visualisere pial arterielle ER-α på forskellige niveauer ved hjælp af Z-stakke. En væsentlig fordel ved EUF software er, at den tillader billedoptagelse på en måde til effektivt at skabe en 3-D billede fra billederne. Til laboratorier, der ikke har adgang til en konfokal mikroskop eller midlerne til at købe en en digital fluorescerende mikroskop med tilegnet software kan være en praktisk og billigere løsning, afhængigt af målene for investigator.
Disclosures
De fremsatte synspunkter er dem af forfatterne og afspejler ikke den officielle politik eller placeringen af uniformerede University of Health Sciences, Department of Defense, eller den amerikanske regering.
Acknowledgments
Arbejdet for dette projekt blev støttet af tilskud fra National Institutes of Health R01-NR5339 og den uniformerede University of the Health Sciences-R061LD.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| EVANS BLUE | Sigma-Aldrich | E-2129 | |
| PBS 10X | Sigma-Aldrich | P-5493 | |
| Paraformaldehyde | Fisher Scientific | T353 | |
| Tissue-Tek O.C.T Compound | VWR international | 25608-930 | |
| Ammonium chloride | Sigma-Aldrich | A9434 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T9284 | |
| Normal Goat Serum | Invitrogen | 16210-064 | |
| ER-α rabbit polyclonal antibody | Santa Cruz Biotechnology, Inc. | H-184 | |
| Oregon green 488 goat anti rabbit IgG | Invitrogen | O-11038 | |
| Vectashield mounting medium for fluorescence with DAPI | Vector Laboratories | H-1200 |
References
- Smiley, D. A., Khalil, R. A. Estrogen compounds, estrogen receptors and vascular cell signaling in the aging blood vessels. Curr. Med. Chem. 16, 1863-1887 (2009).
- Miller, V. M., Duckles, S. P. Vascular actions of estrogens: functional implications. Pharmacol. Rev. 60, 210-241 (2008).
- Duckles, S. P., Krause, D. N. Cerebrovascular effects of oestrogen: multiplicity of action. Clin. Exp. Parmacol. Physiol. 34, 801-808 (2007).
- Stirone, C., Duckles, S. P., Krause, D. N. Multiple forms of estrogen receptor-a incerebral blood vessels: regulation by estrogen. Am. J. Physiol. Endocrinol. Metab. 284, E184-E192 (2003).
- Dan, P., Cheung, J. C., Scriven, D. R., Moore, E. D. Epitope-dependent localization of estrogen receptor-alpha, but not -beta, in en face arterial endothelium. Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 284, 1295-1306 (2003).
- Fritschy, J. M. Is my antibody staining specific? How to deal with pitfalls of immunohistochemistry. Eur. J. Neurosci. 28, 2365-2370 (2008).
- Watanabe, Y., Littleton-Kearney, M. T., Traystman, R. J., Hurn, P. D. Estrogen restores post-ischemic pial and microvascular dilation. Am. J. Physiol. Heart and Circ. 281, H155-H160 (2001).
- Li, M., Zeynalov, E., Li, X., Miyazaki, C., Koehler, R. C., Littleton-Kearney, M. T. Effects of estrogen on postischemic pial artery reactivity to ADP. Microcirculation. 16, 403-413 (2009).
- Qin, X. Y., Hurn, P. D., Littleton-Kearney, M. T. Estrogen restores postischemic sensitivity to thromboxane mimetic U46619 in rat pial artery. Cereb. Blood. Flow. Metab. 25, 1041-1046 (2005).
- Miyazaki, C., Koelher, R. C., Littleton-Kearney, M. T. Effects of HET0016 and estrogen on pial artery vasodilatory capacity. FASEBJ Abstracts. , (2007).
- Daneshtalab, N., Dore, J. J. E., Smeda, J. S. Troubleshooting tissue specificity and antibody selection: procedures in immunohistochemical studies. J. Pharmacol. Toxical. Methods. 61, 127-135 (2010).
- Lorincz, A., Nusser, Z.
