Summary
Målet med denne artikkelen er å vise en metode for å optimalisere immunofluorescent deteksjon av østrogen reseptor-α (ERα) i rotte pial arterielle skiver ved hjelp av en digital immunofluorescent mikroskop.
Abstract
Mange av østrogen har effekt på vaskulær reaktivitet formidles gjennom interaksjon med østrogen reseptorer 1, 2, 3. Selv om to sub-typer eksisterer (østrogenreseptor-α og β), har østrogenreseptor-α blitt identifisert både i glatt muskulatur og i endotelceller av pial arteriell segmenter med fluorescerende flekker kombinert med confocal laser scanning mikroskopi fire. Videre er ER-α ligger i kjerner og i cytoplasma av rotte basilaris arterier 5. Reseptorene er rikelig og fluoresce lyst, men klar visualisering av diskrete grupper av reseptorer er vanskelig sannsynligvis pga tallene ligger i mange celle lag pial fartøy segmenter. I tillegg mange rapporter med immunhistokjemiske teknikker sammen med konfokalmikroskopi dårlig detalj kravene kritisk for reproduksjon av eksperimenter 6. Vårt formål for denne artikkelen er å beskrive en enkel teknikk for å optimalisere tHan flekker og visualisering av ER-α bruke cross-sectional skiver av pial arterioler får fra kvinnelige rottehjerner. Vi først perfuse rotter med Evans blått fargestoff for enkelt å identifisere overflaten pial arterier som vi isolere under et dissekere mikroskop. Bruk av cryostat til skive 8 mikrometer tverrsnitt av arteries lar oss få tynne fartøy seksjoner slik at ulike fartøy flyene er mer tydelig visualisert. På tvers av skipet enn å bruke et lite fartøy segmentet har fordelen av enklere visning av endotelceller og glatt muskulatur lag. I tillegg bruk av en digital immunofluorescent mikroskop med utvidet dybde programvare gir klare bilder av ti til tolv forskjellige fartøy fly og er mindre kostbart enn bruk av confocal laser scanning mikroskop.
Protocol
1. Isolering og Utarbeidelse av Pial Arterier
- Mens rotte er bedøvet sette inn og sikre et kateter inn i en arterie og perfuse med 1% Evans blå i 1X PBS. Pial fartøy flekken godt med Evans blå fargestoffet som gjør dem lettere å isolere.
- Pakk hjernen og oppbevar ved -70 ° C inntil nødvendig. Optimalt bør hjerner lagres lenger enn 2 måneder.
- Ved hjelp av en dissecting mikroskop fjerne pial arterioler (gjennomsnittlig diameter 35-50 mikrometer) fra overflaten av hjernen. Trekk ut alle de blå-farget arterioler fra dorsale og lateral overflaten av cortex bruke fin-tipped tang. Fjern overflødig tilhenger kortikalt vev før de legges i festing.
- Fest høstet arterioler i 2% kaldt Paraformaldehyde i 0.1m PBS i 30 min.
- For å forberede arterioler for seksjonering helle innebygging medium på frysing platen / chuck (sett ved -20 ° C).
- Plasser arteriole delen flatt på chuck ennd vente til det å fryse. Fast sted fartøyet opp til høyre på cryostat fryse disken på innebygging media med spissen av arterien mot deg. Hold den med pinsett til den er solid frosset.
- Plasser frysing platen med fartøyet inn i cryostat hodet og kuttet 8 mikrometer pial arteriole ringer med cryostat.
- Monter arteriole avsnittene om krom-kalium-gelatin subbed lysbilder.
- Oppbevar forberedt lysbilder i et lysbilde boks i kjøleskap ved 4 ° C over natten.
2. ER-α Immunofluorescent farging
Dag 1
- Fjern lysbilder fra kjøleskapet; bringe hver til romtemperatur.
- Å vaske lysbildene hell 1 til 1,5 ml 0.1m PBS (nok til å dekke alle seksjonene) la sitte i 10 minutter, avløp og gjentar prosedyren to ganger mer. Hver kant av lysbildet har en hydrofob markør. Derfor forblir flytende på overflaten av lysbildet. Med hver vask væsken hellesut og erstattet med friske 0,1 M PBS.
- Inkuber lysbilder i 1 ml på 50mm ammoniumklorid i 30 min ved romtemperatur for å redusere endogen fluorescens.
- Vask lysbildene i 0.1m PBS 3x10 min. som beskrevet i 2.2
- Block lysbilder i 0,1% Triton-X 100 pluss 1% normal geit serum (NGS) i PBS i 30 min. å redusere ikke-spesifikk binding.
- Inkuber prøver med den primære antistoff (kanin polyklonale anti-ER-α, 1:500) i PBS + 0,1% Triton-X + 1% NGS over natten ved 4 ° C.
Dag 2
- Fjern lysbilder fra kjøleskapet; bringe hver til romtemperatur.
- Vask lysbildene i 0.1m PBS 3x10 min. som beskrevet i 2.2
- Inkuber med Oregon Grønn 488 sekundære anti-kanin på 1% NGS 0,1% Triton-X100 + PBS for 2 time i mørke ved romtemperatur. Fra dette trinnet, må de neste trinnene gjøres i mørket.
- Vask lysbildene i 0.1m PBS 3x10 min. som beskrevet i 2.2
- Under en ventilated hette, plassere en dråpe 4 ', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) pluss montering media på fartøy og deretter plassere en cover slip over prøven.
- Påfør klar neglelakk for å forsegle kantene av dekselet slip. Ikke flytt lysbildene til det er helt tørt, noe som tar ca 24 timer.
3. Digital Fluorescens Imaging
- For bildebehandling ER-α i pial fartøy slice vi bruker et Nikon Eclipse 80i digital fluorescerende mikroskop med filtre for tre farger (blå, grønn og rød) er utstyrt med et digitalt kamera.
- Sett inn forberedt lysbilder med de fargede pial fartøy segmenter under mikroskopet og tilpasse seg visualisere fluorescensmerkede områder av interesse. Start ved x100 forstørrelse deretter øke til X600 forstørrelse.
- Bruke kameraet til å ta bilder i DAPI (blå) og FITC (grønn) kanaler for cellekjerner (DAPI) og ER-α (Oregon Green) bruker Nikon Extended Dybde Focus programvare for å konvertere flere views av fartøy segmenter i 2-D bilder.
Fire. Representant Resultater:
Vi lokaliserte østrogen reseptor-α i pial arteriell fartøy med fluorescerende prober og optimalisert våre visualisering av reseptoren bruke digitale fluorescens mikroskopi. For å oppdage tilstedeværelsen av reseptoren, en kanin polyklonale primær antistoff og en Oregon Grønn 488 merket sekundære antistoff ble brukt til bilde reseptorene i pial arterier isolert fra overflaten av hjernen. Også et kjernefysisk flekk (DAPI) ble brukt til å identifisere cellekjerner og avgjøre om vi kunne oppdage reseptorer lokalisert i kjernen siden ER-α har blitt rapportert å være til stede i cellen cyotosol og kjernen. I tillegg gjennomførte vi bekreftende eksperimenter for å validere spesifisitet av de primære antistoffet og å verifisere binding av den sekundære til den primære antistoffet.
Figur 1. Immunofluorescent farging for ER-α (grønt) og kontrafarging med DAPI (blå) i en pial arterie ring isolert fra hunnrotte hjernen. Fig 1A viser det fusjonerte bildene antyder tilstedeværelsen av noen intranuclear østrogen reseptor-a (pil). Fig. 1b og 1c er fokusert bilde av ER-α som er en kombinasjon av Z-stack bilder. Bildene ble tatt på X600 forstørrelse og er fra kuttet ringen av samme fartøy i forskjellige plan. Pilene viser østrogenreseptor-α.
Figur 2. Immunofluorescent flekker for kontroll grupper i et pial arterie ring isolert fra hunnrotte hjernen. Fig 2D viser fartøyet uten primære antistoff. Fig 2E viser fartøyet uten sekundær antistoff (merk tydelig autofluorescence langs endotelial side). Bildene ble tatt på X600 forstørrelse og er fra kuttet ringen på samme fartøy i different fly.
Discussion
Tidligere viste vi at etter transitorisk global iskemisk hjerneskade de pial lunge kapasitet til å endre diameter i respons til både 7 vasodilatorer, 8 og vasokonstriktorer 9 er markert deprimert i ung ovariectomized rotter. Kronisk østrogen repletion gjenoppretter vasomotoriske responser 7-9. Videre reverserer forsinket østrogen erstatning de gunstige effektene av østrogen på pial arterie vasodilaterende kapasitet 10 fører oss til spørsmålet om langsiktig østrogen uttømming påvirker ER-α tetthet i cerebrovasculature. Vi planla å bruke immunofluorescent merking kombinert med western blotting å vurdere endringer i ER-α uttrykk som respons på kronisk østrogen utarming. Fordi vi hadde litt problemer med visualisering av diskrete grupper av reseptorer vi endret metode som vi viser her. Derfor var vårt primære mål i denne studien er å først utvikle en relativt enkel metode for å optimalisere den visuellevisualisering av reseptorer i pial arterioler. Etter avtale med flere rapporter 6,11,12 fant vi det nødvendig å foreta justeringer for den type vev vi var undersøkelser, prøven tykkelse, fordelingen av ER-α i fartøyet, samt graden av ikke-spesifikk binding .
Vår metode er svært effektiv for å visualisere tilstedeværelsen av ER-α i pial fartøy skiver. Men som andre har tidligere pekt på vellykket bruk av disse metodene er svært avhengig av spesifisitet og konsentrasjoner av antistoffer, det subcellular plasseringen av proteiner av interesse, fiksering og blokkering protokoller og vev håndtering 12. Før visualisering av våre fartøy forberedelser brukte vi tid til å trene alle disse variablene. Vi har fremhevet hvordan vi trengte å justere noen av vår tilnærming i denne artikkelen.
Vi satte ut for å optimalt visualisere ER-α i pial arterioler og dette presenteres noen utfordringer.Først er den gjennomsnittlige størrelsen på en rotte pial arterie mellom 35-50 mikrometer lage isolasjon og fjerning fra hjernen overflaten litt kinkig. Vi fant at perfusjon med Evans blue dye før ofre blir disseksjon av blodårene lettere. Evan er blå kan påvirke fluorescens, men vi føler at fordelen av å bruke denne fargestoff oppveie dens mindre ulemper. I protokoll våre fartøy er vasket flere ganger. Dette minimerer gjenværende fargestoff i blodårene og reduserer mulige effekter av fargestoff på fluorescens. En annen vanskelighet vi møtte var at tykkelsen på pial skipet segmentene gjøres klart visualisering av reseptorer vanskelig. I tillegg kunne vi ikke få spesielt klare bilder trolig på grunn av det faktum at ER-α ble spredt gjennom flere cellelag. Vi prøvde å jobbe med langsgående fartøy skiver (som andre har), men på grunn av den lille pial størrelsen var det vanskelig å håndtere fartøy og hindre vridning av skipene mens monteringpå lysbilder selv ved hjelp av et mikroskop. Til slutt, vi lykkes endret vår teknikk ved hjelp av en cryostat og kutte fartøyet tvers kloke i til 8 mikrometer tykke ringer. Ringene er enklere å håndtere og flere kan monteres på ett lysbilde.
Når vi kjøpte skipene vi følte det nødvendig å teste effektiviteten av første flash fryse vevet deretter feste fartøyene som foreslått av Danseshatalb og tilknyttede selskaper 11. Selv om vi fant marginalt mindre bakgrunn immunfluorescens vi også bemerket at reseptorene beiset mindre intenst gjør visualisering av reseptorer vanskeligere. Derfor foretrekker vi å først å fryse hele hjernen og lagre inntil nødvendig (vanligvis mellom 1-2 måneder). Vi så trekke av skipene som beskrevet og fikse skipene før slicing med cryostat. som vi viser her.
Et nødvendig skritt er å kjøre kontroller med både primære og den sekundære antistoff separatå bestemme spesifisitet og bakgrunn immunfluorescens. Østrogen reseptor-α-antistoffer kan være vanskelig å jobbe med. Faktisk prøvde vi 3 forskjellige primære antistoffer (1 monoklonalt og 2 polyklonale) før vi var fornøyd med suksessen til våre reseptor farging. Som en del av våre kontroller vi først bekreftet spesifisiteten av primære antistoffet ved unnlatelse av tillegg av den primære antistoffet. Figur 2D viser fartøyet uten primære antistoff. Det er ingen flekker og litt bakgrunn signal. Siden den primære antistoffet er polyklonale, det er noe diffus ikke-spesifikk bakgrunn farging. Dernest, la vi den primære antistoffet, men ikke de sekundære antistoff (Fig. 2E). Man kan se en fin margin representerer autofluoresence langs endoteliale grensene av fartøyene. Dette er konsistent med arbeidet til Dan og samarbeidspartnere 5. Men verken små punkter av immunfluorescens som representerer ER-α, eller kornet utseende reflecting tilstedeværelsen av mange reseptorer kan oppdages uten kombinasjonen av både primære og sekundære antistoffer. Vi merket en distinkt mønster av autofluoresence langs endoteliale marginene av fartøyene. Disse uavhengige tester for antistoffspesifisitet er viktige fordi de bekrefter spesifisiteten av antistoff til ER-α og den sekundære antistoffet binder seg til den primære.
I konklusjonen, som demonstrert av andre 4, 5 hjernen blodårer inneholder mange ER-α sub-type reseptorer. I våre hender, forbereder 8μm tverrsnitt skiver fra isolerte pial arterier forbedrer flekker og visualisering av reseptorer. Tradisjonelle metoder bruker konfokalmikroskopi å undersøke prøvene. Å ha evnen til å vise seriell optisk seksjoner fra tykk prøver er en viktig fordel med konfokalmikroskopi. Imidlertid kan kjøpe en god confocal mikroskop være svært kostbart. Ved å bruke Extended Dybde (EDF) programvare, fant vi atkunne redusere vårt utstyr kostnader. Ved hjelp av en fluorescerende mikroskop med EDF vi fått klare bilder og er i stand til å visualisere pial arteriell ER-α på flere nivåer ved hjelp Z-stabler. En betydelig fordel av EDF programvare er at det tillater fotografering på en måte å effektivt lage en 3-D bilde fra bildene. For laboratorier som ikke har tilgang til en confocal mikroskop eller midler til å kjøpe en digital fluorescerende mikroskop med tilegnet programvare kan være en praktisk og mindre kostnadskrevende alternativ avhengig av målene for etterforskeren.
Disclosures
Synspunktene er de av forfatterne og gjenspeiler ikke den offisielle politikk eller stilling Uniformert Services University of the Health Sciences, Department of Defense, eller myndighetene i USA.
Acknowledgments
Arbeidet for dette prosjektet ble støttet med tilskudd fra National Institutes of Health R01-NR5339 og Uniformert Services University of the Health Sciences-R061LD.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| EVANS BLUE | Sigma-Aldrich | E-2129 | |
| PBS 10X | Sigma-Aldrich | P-5493 | |
| Paraformaldehyde | Fisher Scientific | T353 | |
| Tissue-Tek O.C.T Compound | VWR international | 25608-930 | |
| Ammonium chloride | Sigma-Aldrich | A9434 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T9284 | |
| Normal Goat Serum | Invitrogen | 16210-064 | |
| ER-α rabbit polyclonal antibody | Santa Cruz Biotechnology, Inc. | H-184 | |
| Oregon green 488 goat anti rabbit IgG | Invitrogen | O-11038 | |
| Vectashield mounting medium for fluorescence with DAPI | Vector Laboratories | H-1200 |
References
- Smiley, D. A., Khalil, R. A. Estrogen compounds, estrogen receptors and vascular cell signaling in the aging blood vessels. Curr. Med. Chem. 16, 1863-1887 (2009).
- Miller, V. M., Duckles, S. P. Vascular actions of estrogens: functional implications. Pharmacol. Rev. 60, 210-241 (2008).
- Duckles, S. P., Krause, D. N. Cerebrovascular effects of oestrogen: multiplicity of action. Clin. Exp. Parmacol. Physiol. 34, 801-808 (2007).
- Stirone, C., Duckles, S. P., Krause, D. N. Multiple forms of estrogen receptor-a incerebral blood vessels: regulation by estrogen. Am. J. Physiol. Endocrinol. Metab. 284, E184-E192 (2003).
- Dan, P., Cheung, J. C., Scriven, D. R., Moore, E. D. Epitope-dependent localization of estrogen receptor-alpha, but not -beta, in en face arterial endothelium. Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 284, 1295-1306 (2003).
- Fritschy, J. M. Is my antibody staining specific? How to deal with pitfalls of immunohistochemistry. Eur. J. Neurosci. 28, 2365-2370 (2008).
- Watanabe, Y., Littleton-Kearney, M. T., Traystman, R. J., Hurn, P. D. Estrogen restores post-ischemic pial and microvascular dilation. Am. J. Physiol. Heart and Circ. 281, H155-H160 (2001).
- Li, M., Zeynalov, E., Li, X., Miyazaki, C., Koehler, R. C., Littleton-Kearney, M. T. Effects of estrogen on postischemic pial artery reactivity to ADP. Microcirculation. 16, 403-413 (2009).
- Qin, X. Y., Hurn, P. D., Littleton-Kearney, M. T. Estrogen restores postischemic sensitivity to thromboxane mimetic U46619 in rat pial artery. Cereb. Blood. Flow. Metab. 25, 1041-1046 (2005).
- Miyazaki, C., Koelher, R. C., Littleton-Kearney, M. T. Effects of HET0016 and estrogen on pial artery vasodilatory capacity. FASEBJ Abstracts. , (2007).
- Daneshtalab, N., Dore, J. J. E., Smeda, J. S. Troubleshooting tissue specificity and antibody selection: procedures in immunohistochemical studies. J. Pharmacol. Toxical. Methods. 61, 127-135 (2010).
- Lorincz, A., Nusser, Z. Specificity of immunoreactants. J. Neurosci. 28, 9083-9086 (2008).
