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Neuroscience

Korrelation von Verhaltensreaktionen auf fMRI Signalen von Human präfrontalen Kortex: Untersuchung kognitiver Prozesse mit dem Task Analysis

doi: 10.3791/3237 Published: June 20, 2012

ERRATUM NOTICE

Summary

Das Ziel unserer Forschung ist es, Verhalten zu Hirnaktivität korreliert. Genaue Verhaltensmaßnahmen und bildgebenden Verfahren ermöglichen es uns, Gehirn-Verhalten Zusammenhänge aufzuklären.

Abstract

Das Ziel dieses Papiers ist es, Methoden beschreiben, wie eine bildgebende Technik, um komplementäre Prozesse im Gehirn durch zwei ähnliche Aufgaben engagiert untersuchen zu implementieren. Das Verhalten der Teilnehmer während der Ausführung der Aufgaben in einer fMRI-Scanner kann dann an das Gehirn Aktivität über die Blut-Sauerstoff-Level-Signals korreliert werden. Wir messen das Verhalten in der Lage sein, um eine korrekte Studien zu sortieren, wo das Thema die Aufgabe korrekt durchgeführt und dann in der Lage sein, zu prüfen, die Signale des Gehirns in Bezug auf Leistung zu korrigieren. Umgekehrt, wenn Personen sich für die Aufgaben richtig, und diese Versuche werden auf die gleiche Analyse mit den richtigen Studien einbezogen würden wir einführen Studien, die nicht nur für die korrekte Durchführung waren. Daher wird in vielen Fällen können diese Fehler selbst verwendet werden, um dann korreliert Hirnaktivität an ihnen. Wir beschreiben zwei sich ergänzende Aufgaben, die in unserem Labor verwendet werden, um das Gehirn während der Unterdrückung einer automatischen Reaktionen zu untersuchen: der Stroop-1 und anti-Sakkade Aufgaben. Dieemotionalen Stroop-Paradigma instruiert die Teilnehmer entweder zu berichten, die überlagert emotionale "Wort" über die affektiven Gesichter oder den Gesichtsmuskeln 'Ausdrücke' des Gesichts Reize 1,2. Wenn das Wort und die Mimik auf verschiedene Emotionen beziehen, muss ein Konflikt zwischen dem, was gesagt werden und was wird automatisch gelesen auftritt. Der Teilnehmer hat, um den Konflikt zwischen zwei konkurrierenden Prozessen gleichzeitig von Wort lesen und Mimik zu lösen. Unser Drang zum Auslesen eines Wortes führt zu starken "Reiz-Reaktions-(SR) Vereinigungen, daher diese starke Hemmung der SR ist schwierig und Teilnehmer sind anfällig für Fehler zu machen. Die Überwindung dieses Konflikts und die Aufmerksamkeit weg vom Gesicht oder das Wort verlangt die Gegenstand von unten nach oben an, die normalerweise lenkt die Aufmerksamkeit auf die weitere markante Impulse zu hemmen. In ähnlicher Weise, in der Anti-Sakkade Aufgabe 3,4,5,6, wo ein Befehl Cue verwendet, um nur auf einer peripheren Reiz Ort zu lenken ist, aber dann eye Bewegung wird zum Spiegel entgegengesetzte Position gemacht. Erneut messen wir das Verhalten durch Aufzeichnung der Augenbewegungen der Teilnehmer, die für die Sortierung der Verhaltensreaktionen in korrekt und fehlerfrei sind Versuche 7, die dann die Hirnaktivität korreliert werden können. Neuroimaging jetzt können die Forscher unterschiedliche Verhalten der korrekt und fehlerfrei sind Studien, die indikativ für unterschiedliche kognitive Prozesse sind und dabei das unterschiedliche neuronale Netzwerke eingebunden zu messen.

Protocol

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1. Vor Eintritt in den MRT-Raum

  1. Teilnehmer absolvieren eine Einverständniserklärung zu erklären, alle experimentellen Risiken (zB Herzschrittmacher, Klaustrophobie, metallische Implantate, Chance auf eine Schwangerschaft, usw.), und den Nutzen ihrer Teilnahme.
  2. Alle Teilnehmer sind verpflichtet, füllen Sie das MRI-Sicherheit und Screening-Fragebogen (kurze Anamnese, frühere chirurgische Eingriffe usw.) Teilnehmer mit Kontraindikationen ausgeschlossen werden müssen.

2. Übersicht über den Task-und Weiterbildung

  1. Schulungsmaßnahmen zu Aufgabenwahrnehmung auf Anti-Sakkaden.
    1. Grüne Fixierung deutet auf eine Pro-Sakkade-Studie. Weisen die Teilnehmer an das Ziel, das in der Peripherie des Bildschirms zu sehen, bei einem Blickwinkel von 8-10 °.
    2. Red Fixierung deutet auf eine Anti-Sakkaden-Studie. Weisen zum Bezug der Spiegel gegenüber der Target, das in der Peripherie des Bildschirms zu sehen, bei einem Blickwinkel von 8-10 ° (zB für richtige Ziel, um zu sehen the links).
  2. Schulungsmaßnahmen zu Aufgabenwahrnehmung für die emotionale Stroop außerhalb des Scanners.
    1. Gehören 15 Praxis-Studien mit verschiedenen Kombinationen von Gesicht-Wort-Ausdrücke auf einem Computer außerhalb des Scanners. Der Zweck der Übung ist für die Teilnehmer die Aufgabe, lernen, und was von ihnen in Drücken der entsprechenden Taste in der MRI-Scanner erwartet. Weisen Sie als Teilnehmer an die Tasten sind für die Berichterstattung einen glücklichen Ausdruck / Wort, neutralen Ausdruck / Wort und traurigen Ausdruck / Wort gedrückt. Außerdem, wenn das Innere des Scanners, erinnern die Teilnehmer, von denen jede Emotion Schaltfläche repräsentiert.
    2. Beschreibende Wörter anzeigt, die Ausdrücke (Happy, neutral, traurig) werden über die Bilder der einzelnen Flächen überlagert. Diese Worte sind entweder kongruent oder inkongruent mit dem Gefühl durch das Gesicht auf dem Bild (Abbildung 1) dargestellt. Beginnen Sie jeden Scan mit einer schriftlichen Anweisung auf dem Bildschirm erinnert die Teilnehmer entweder zu report des "Gesichtsausdruck (fröhlich, neutral, traurig)" oder das "geschriebene Wort (glücklich, neutral, traurig)" durch Drücken der entsprechenden Taste so schnell wie möglich.
    3. Die Anweisung wird für 1 Sekunde angezeigt, gefolgt von einer Fixierung Kreuz, das die Teilnehmer auf noch 1 sec fixiert. Die Fixierung wird durch Querschnitt der Gesichter für 250 Millisekunden und dann durch die Reaktion Bild für 2 Sekunden präsentiert, gefolgt gefolgt. Die Resonanz Foto benutzt wird, um den Teilnehmern Zeit, um ihre Reaktionen durch Drücken des entsprechenden Buttons mitteilen. Der nächste visuelle Darstellung des Fixationskreuz beginnt nach dem Ende dieser Reaktion Bild. Jeder Teilnehmer wiederholt den experimentellen Scan in einem der beiden Gruppen Unterricht (dh, Gesicht, Ausdruck oder geschriebene Wort). Alle Stimuli wurden erstellt und präsentiert mit Presentation 12,1 ( www.neurobs.com ).

3. Scanner und Eye Tracking-Setup

  1. Um bEgin die sich aus dem Experiment gesetzt, durch die Projektion der Computer Stimulus als fokussiertes Bild auf den Monitor in der MRT mit einem digitalen Projektor zu starten.
  2. Die Teilnehmer werden gebeten, aufzustehen von ihrem Stuhl in der Leitwarte und gehen in den Scanner ein Zimmer. Ohrstöpsel und / oder Kopfhörer sind vorhanden und Themen legen Sie sie in ihre Ohren Kanäle.
    1. Das Thema befindet sich in Rückenlage mit dem Kopf Position zur Mitte des Kopfes Spule. Wir stabilisieren Teilnehmers Körper-und Kopfhaltung mit Kissen oder Schaumstoff-Einlagen, um sie so angenehm wie möglich, sondern auch zur Unterstützung bei der Einschränkung ihrer Bewegung des Kopfes seit Kopfbewegungen während des Scannens Ursachen Verlust von Daten. Insbesondere wenn der Kopfbewegung größer als 1 mm in jeder Richtung.
    2. Schieben / Stellen Sie das Kopfspule über der Kopfgröße des Teilnehmers und sie neigen ihren Kopf so bequem wie möglich, während Sie weiter geradeaus auf den Spiegel, ob der Projektor Bildschirm reflektiert sehen. Die Augen müssen so nah erste Position als pÖGLICHE 8, um den Teilnehmer Komfort über den Scan-Sitzung auf die Dauer von bis zu zwei Stunden zu halten.
  3. Bitten Sie die Teilnehmer, wie der Fokus des projizierten Bildes, wenn sie im Scanner befinden ist. Wenn es nicht scharf ist, neu zu justieren Sie das Objektiv, um das Bild auf dem Bildschirm zu verbessern.
  4. Die Augenverfolger wird nun anhand einer Kalibrierung getestet, um sicherzustellen, dass die IRED Kamera in der richtigen Lage ist. Wenn die Reflexion auf der Hornhaut ist nicht ideal oder nicht ordnungsgemäß funktioniert, muss der IRED Quelle angepasst werden, oder der Spiegel, der IRED Quelle in der Nähe der Kopfgröße des Teilnehmers Position muss neu ausgerichtet / eingestellt werden. Wenn der Kopfgröße des Teilnehmers angepasst wurde, fragen Sie den Gegenstand, wenn mehr Polsterung / Schaumstoff oder Kissen benötigt werden, um diesen Kopf / Körper Position zu halten. Beim Scannen Überwachen und Aufzeichnen der Teilnehmer horizontale und vertikale Augenpositionen über eine Infrarot-Eye-Tracker (dh Sensomotoric Instruments, Needham / Boston, MA) und korrelieren diese mit dem Verhaltens-Paradigma when Analyse von Gehirnaktivität. 5,7

4. Scan-Verfahren

  1. Legen Sie die Notfall-Kontakt Squeeze Ball auf den Bauch des Teilnehmers in der linken Hand und dem Joystick Taste / Box in der rechten Hand. Stellen Sie ein Vitamin E Kapsel auf der rechten Seite in der Nähe des Kopfes. Dies wird von den anatomischen Scans, die bestimmte einen Fehler machen wird sichtbar wird nicht klappen Sie die Bilder von links nach rechts. Heben und schieben das Bett in der Mitte des MRI.
  2. Sicher, dass alle von den Experimentatoren verlassen den MRT-Raum und schließen Sie die Tür zum MRT.
  3. Mit dem Teilnehmer kommunizieren über die Sprechanlage in der Leitwarte und bestätigen, dass sie bereit sind, Scannen beginnen und sind so bequem wie möglich. Wenn nicht, justieren, wie gebraucht.
  4. Erinnern Sie die Teilnehmer, dass die Geräusche in den Scanner wird laut sein und das ist normal.
    1. Der erste Scan speichert einige Gehirn Bilder entlang der sagittalen Region zu lokalisieren zu können / schreiben die genaue oderientation der Scheiben für die vollständigen anatomischen und funktionellen Daten. Die Teilnehmer werden erzählt dieser Scan wird einige Minuten dauern.
    2. Sobald die Experimentatoren die Ergebnisse der Localizer-Scan anzuzeigen, verschreiben wir eine Reihe von anatomischen Schnitten, die das gesamte Gehirn zu decken. In unseren Fällen sind wir in der Regel scannen axiale schräge Scheiben schneiden, die das gesamte Gehirn (170 bis 256 Scheiben) umfassen. Teilen Sie den Teilnehmern, dass diese Überprüfung wird etwa 6 bis 10 Minuten abhängig von der vorgegebenen Anzahl von Schnitten zu nehmen. In einigen Fällen kann die anatomische Scan nach den funktionellen Scans durchgeführt werden. Es gibt einige Vorteile des letzteren, in der Regel in langen Experimenten Probanden erleben Müdigkeit. Daher muss das anatomische Scan keine Aufmerksamkeit durch die Personen, damit sie ihre Augen schließen kann. Es könnte nützlich sein, um diese Scans am Ende des Imaging-Sitzung zu tun.
    3. Sobald anatomischen Scans abgeschlossen sind, ist der Teilnehmer von den spezifischen Anweisungen des kommenden Scan durch Kommunikation über das Mikrofon erinnerte/ Lautsprecher-System.
  5. In diesem Beispiel wird ein Pseudo-Event-bezogenen Design 2 verwendet, um die Hirnregionen von der emotionalen Stroop-Aufgabe aktiviert zu identifizieren, sondern eine sensorische, innere Wahrnehmung 9 oder Bewegungsreiz 10 könnte für den Einsatz geleitet werden, wenn nötig. Nachdem diese gescannt werden, dann werden wir das Thema anweisen, dass der Anti-Sakkaden-Paradigma nächsten gescannt werden. Abhängig von den Abbildungsparameter gewählt wird der Scan nahe zu sein, 6 Minuten lang. Wir finden, dass Scans länger als diese Themen veranlassen, um einzuschlafen.
  6. Die gesamte Imaging-Sitzung dauert ca. 60 bis 120 Minuten, je nach der Gesamtanzahl der Scans für die Analyse benötigt.

5. fMRT-Analyse

  1. Analysieren Sie die Daten mit Hilfe BrainVoyager QX-Software (oder ein Analyse-Paket wie AFNI oder SPM).
  2. Beginnen Sie mit der Überlagerung von funktionellen Daten statistische Karten auf anatomische Bilder des Gehirns. Funktionell definieren die Regionen des Gehirns von Interesse (ROWird) mit Hilfe des allgemeinen linearen Modells (GLM), mit separatem Prädiktoren (dh kongruent und inkongruent, Gesichts-Unterricht und Unterweisung Wort, Anti-Sakkaden-, Pro-Sakkade) für jede der Bedingungen in der Aufgabe in den zwei Arten von Scans 2.
  3. Untersuchen Sie die Signalintensität in allen aktivierten frontalen Regionen aus den GLM Kontraste (dh alle inkongruent gegenüber allen kongruenten um eine Karte der Gebiete zu produzieren), berechnen die standardisierte BOLD-Signal über alle Teilnehmer und vergleichen Sie das Wort inkongruent / Gesichtsausdruck mit der kongruenten Wort / Gesichter Ausdrücke für beide Bedingungen 2.
  4. Korrelieren die Reaktionszeiten auf die Prüfungen, die für die GLMs verwendet wurden gesammelt, dann korrelieren Hirnaktivität über jede einzelne mit ihrem eigenen Reaktionszeiten für die spezifischen Versuche 2 wie in 4.

6. Repräsentative Ergebnisse

Nach der Analyse zeigen wir Hirnregionen, die mit der E korrelierenBewegungs Stroop-und Anti-Sakkaden Aufgaben beim Scannen erfasst. Die Ergebnisse aus der emotionalen Stroop-Paradigma ergab einen signifikanten Interaktionseffekt zwischen allen drei Faktoren des Ausdrucks, Belehrung und Hirnregion, aber es war kein Haupteffekt der Meinungsäußerung und keinen Haupteffekt des Unterrichts 2. Wir fanden, dass, wenn der Ausdruck des Gesichtes inkongruent zum überlagert emotionale Wort war, diese Inkongruenz von der Berichterstattung das geschriebene Wort erzeugt höhere BOLD-Signal-Intensität in der linken IFG 2 (Abbildung 2) zeigte. Die größere Signalstärke auf den inkongruenten Ausdrücke im Vergleich zu den kongruenten Ausdrücken war statistisch signifikant, mit glücklichen deckungsgleich mit dem größten Unterschied 2.

Am wichtigsten ist die RTS für die drei inkongruenten Bedingungen getestet (traurig, glücklich und neutral) prognostiziert eine erhöhte BOLD-Signal im linken IFG im Vergleich zu allen kongruenten Bedingungen (Abbildung 3). Aus diesem anaLyse wir speziell untersuchte die Reaktionszeiten und eine Regressionsanalyse durchgeführt, um zu testen, ob RT für die inkongruenten und kongruenten Bedingungen prädiktive des BOLD-Signal-Aktivität in dieser Hirnregion (Abbildung 3) waren. Wir fanden, dass RT-Konten für 81% der Variation in der linken IFG Aktivität, bei der Berichterstattung das Wort Ausdruck von Happy, Neutral, und traurig in den inkongruenten und kongruenten Bedingungen 2. Höhere RT ist prädiktiv für größere linken IFG-Aktivierung, mit der inkongruenten Bedingung traurig was die größte RT / Signalintensitätsverhältnis Vergleich zu allen anderen Bedingungen Ausdruck. Es wurden die Anti-Sakkade Paradigmen mit ähnlichen Methoden wie oben in der Lage sein, die zwei Netze von Aktivität zu vergleichen. In diesem Beispiel haben wir festgestellt, dass es keine erhöhten Signal in der linken IFG für die Anti-Sakkade gegenüber dem Pro-Sakkade Aufgabe. Für weitere Einzelheiten verweisen wir den Leser auf Ford et al. (2007).

1 Abbildung 1. Ein Beispiel für eine inkongruente Studie (Gesicht mit einem glücklichen Ausdruck durch das Wort überlagert SAD). Das Experiment wird mit dem Punkt Fixierung (1 Sekunde) beginnen, ausgehend vom Gesicht Stimulus (250 ms) und das maskierte Bild (2 Sekunden), die der Teilnehmer Schaltfläche Antwort erfordert.

2
Abbildung 2. Alle Fixierung Bände wurden als Grundlage verwendet. Fehlerbalken bezeichnen den Standardfehler der Mittelwerte (SEM). Inkongruente Ausdrücke (Happy, neutral, traurig) zeigten eine signifikant größere BOLD Signaländerung im Vergleich zu kongruenten Ausdrücken 2. Das eingesetzte Bild zeigt linken inferioren frontalen Gyrus (IFG), die funktional lokalisiert wurde mit Hilfe der Kontrast beschreiben in Abschnitt 5.2 für die inkongruenten emotionalen Stroop gegenüber dem kongruenten Bedingung während der zu Wort Befehlssatz zu besuchen.

"Abbildung Abbildung 3. Während der "Kümmern Sie sich um Word" Unterricht, zeigte inkongruente-kongruent Gegensatz eine positive Korrelation zwischen der RTS und BOLD-Signal-Intensität. Dieser Graph ist ein Mittelwert aus allen 10 Fächern 'RTS und BOLD-Signal während jeder der sechs Bedingungen. Fehlerbalken bezeichnen den Standardfehler der Mittelwerte (SEM) 2.

Abbildung 4
Abbildung 4. Zwei Wiederholungen der einzelnen Ausdrücke wurden den Probanden angezeigt. Obere Reihe ist eine schematische Darstellung eines Prozesses Sequenz von einem Block von Versuchen. Unterteil ist eine Darstellung des Zwei-Gamma-Funktion hämodynamischen Antwort (HRF) verwendet werden, um Hirnregionen in den emotionalen Gesichtsausdrücke beteiligt zu entdecken.

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Discussion

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Identifizieren Hirnregionen beruht zum Erstellen einer genauen Kontrast zwischen den Aufgaben untersucht (dh entweder in der Stroop, inkongruente gegenüber kongruent Emotion und Gesichtsausdruck, oder Anti-Sakkade gegenüber Pro-Sakkade), um eine Straßenkarte der Aktivierung im Zusammenhang mit der Aufgabe zu erzeugen. Diese funktionellen Karten kann mehr verfeinert, wenn das Verhalten im Scanner wird gesammelt, um Studien, in denen das Subjekt gemacht Fehler zu entfernen. Diese Fehler können entfernt werden und, wenn ausreichende Anzahl von Fehlern als Funktionskarten könnte dieser 3,4,5,6 gemacht werden. Am wichtigsten ist, bei der Prüfung der Reaktionszeiten für den Stroop-Aufgabe inkongruente Aufgaben, die längere Reaktionszeiten, hatten auch höhere BOLD-Signale im linken frontalen Kortex (IFG). Wenn wir nicht sammeln diese Verhaltensdaten hätten wir nicht diese neue Einblicke in präfrontalen Kortex 2.

Diese Technik ermöglicht die Messung von Mustern von Aktivität in Hirnregionen mit einem bestimmten sein zugeordnettensweisen hervorrufen wie korrekt und fehlerfrei sind Versuche 7 mit Maßnahmen beim Drücken der Tasten 2 oder Augenbewegung Aufnahmen. Die Herausforderung für die Verwendung dieser Techniken besteht in der eine eindeutige Zuordnung der Verhaltensdaten, die in der Größenordnung von Millisekunden gemessen werden kann, mit den funktionellen Daten von Blutfluss (BOLD-Signal), das eine zeitliche Auflösung von 4-5 weist abgeleitet (4 ). Daher, um neuronale Aktivität mit einem bestimmten Verhalten assoziiert werfen, muss die Verzögerung, mit Hämodynamik zugeordnet berücksichtigt werden. Mit der rasch präsentierten Stimuli, tritt der Anstieg der BOLD-Signal über den Verlauf der Präsentation von mehreren Gesicht / Wort-Paar Reize. Um an der Wirkung der Kongruenz (oder eines bestimmten Gesichtsausdruck) schauen wir müssen diese Unterschiede in der zeitlichen Auflösung von sequentiell präsentiert zwei der gleichen Art Stimulus zu überwinden. Dies wird in Abbildung 4, wobei die ersten beiden Stimuli sind zwei inkongruente-glückliches Gesicht Präsentationen fo gezeigtllowed durch zwei inkongruente-neutral und zwei inkongruente traurig. So wird ein Gegensatz, auf den Vergleich mit Kongruenz Inkongruenz beruht umfassen ein 6,5 s-Block, lange genug, um die hämodynamischen Antwort zu erfassen.

Darüber hinaus schafft Bewegung der Teilnehmer während des Abtastens der Verzerrungen im Magnetfeld und dies kann künstliche Aktivierung in den Ergebnissen führen können oder funktionellen Aktivierung in der falschen anatomischen Position zu verschieben. Exzessive Bewegung von Probanden, während in den Scanner kann durch den Experimentator zu sehen und Themen finden Sie erinnerte bleiben so ruhig wie möglich zwischen den Scans werden. Weitere Korrektur für Bewegung kann durchgeführt werden in Post-hoc-Software, aber Bewegung größer als wenige Millimeter führt in der Regel eine funktionelle Scan verworfen wird. Hier fanden wir keine Taste drückt führte zu einer signifikanten Verschiebung der Arm und Kopf, aber die Bewegung des Probanden während der Scans müssen sorgfältiger Überlegung für jeden Paradigma requirin gegeben werdeng selbst kleine Bewegungen.

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Disclosures

Wir haben nichts zu offenbaren.

Acknowledgments

Gefördert von der National Science and Engineering Research Council (NSERC) zu JFXD, Fakultät für Gesundheitswissenschaften, York University und Autor SO hat PhD Finanzierung durch die Ontario Problem Gambling Research Centre (OPGRC).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
3-Tesla MRI machine Siemens Magnetom Trio (Erlangen, Germany)
iViewX Eye Tracking SensoMotoric Instruments, Inc.
BrainVoyager QX software Brain Innovation, Maastricht, The Netherlands
Four-button Joystick Current Designs, Inc., Philadelphia, PA, USA
Table 1. Specific Reagents and Equipment.

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References

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  10. DeSouza, J. F. X. Eye position signal modulates a human parietal pointing region during memory-guided movements. J. Neurosci. 20, 5835-5840 (2000).

Erratum

Formal Correction: Erratum: Correlating Behavioral Responses to fMRI Signals from Human Prefrontal Cortex: Examining Cognitive Processes Using Task Analysis
Posted by JoVE Editors on 08/03/2012. Citeable Link.

A correction was made to Correlating Behavioral Responses to fMRI Signals from Human Prefrontal Cortex: Examining Cognitive Processes Using Task Analysis. Joseph DeSouza and Laura Pynn middle initials were omitted at publication.

These have been corrected to:

Joseph F.X. DeSouza

Laura K. Pynn

Korrelation von Verhaltensreaktionen auf fMRI Signalen von Human präfrontalen Kortex: Untersuchung kognitiver Prozesse mit dem Task Analysis
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Cite this Article

DeSouza, J. F. X., Ovaysikia, S., Pynn, L. K. Correlating Behavioral Responses to fMRI Signals from Human Prefrontal Cortex: Examining Cognitive Processes Using Task Analysis. J. Vis. Exp. (64), e3237, doi:10.3791/3237 (2012).More

DeSouza, J. F. X., Ovaysikia, S., Pynn, L. K. Correlating Behavioral Responses to fMRI Signals from Human Prefrontal Cortex: Examining Cognitive Processes Using Task Analysis. J. Vis. Exp. (64), e3237, doi:10.3791/3237 (2012).

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