Summary
يوصف بسيطة ، طريقة سريعة لتحديد إمكانية تسكر أعداد كبيرة من عينات الكتلة الحيوية النباتية. النظام الأساسي لهذا التحليل الآلي ينطوي على إعداد الكتلة الحيوية النباتية للتحليل في 96 لوحات جيدة وأداء لاحقة من التحلل ، المعالجة وتقدير من السكريات الافراج عنهم.
Abstract
ويمكن تقسيم السكريات التي تشكل الكتلة الحيوية النباتية lignocellulosic وصولا الى انتاج مجموعة من السكريات التي يمكن استخدامها لاحقا في إنشاء معامل تكرير أحيائية. وهذه الخامات تشكل منصة الصناعية الجديدة ، وهما أمران غير المستدامة ومحايدة الكربون ، لتحل محل الاعتماد الحالي على الوقود الأحفوري. تنتج تمردات لتفكيك المواد التي لوحظت في الخصائص الذاتية التي lignocellulosic العديد من جدران الخلايا النباتية. السليلوز البلورية مضمن في مصفوفة مثل السكريات وxylans arabinoxylans ، والهيكل كله المغطى من قبل الفينولية البوليمر اللجنين ، وهذا هو أيضا صعبة الهضم 1. من أجل تحسين هضم المواد النباتية نحن بحاجة لاكتشاف الاختناقات الرئيسية لتسكر من جدران الخلايا ومتحولة أيضا شاشة تربية والسكان لتقييم التغير في تسكر 2. هذه المهام تتطلب نهجا إنتاجية عالية ، وهنا نقدم منصة التحليلية التي يمكن القيام بتحليل التسكير في شكل لوحة 96 - جيدا. وقد تم تطوير هذا النظام الأساسي للسماح للفحص هضم lignocellulose أعداد كبيرة من السكان من الأنواع النباتية المختلفة. وقلصت نحن باستمرار حجم رد فعل لمعالجة مسبقة لطيف ، الإنزيمية جزئية والتصميم والسكر ، والسماح لأعداد كبيرة بسرعة المقررة في النظام الآلي.
هذا البرنامج يعمل آليا مع كميات مليغرام من الكتلة الحيوية ، وأداء طحن الكرة في ظل ظروف خاضعة للرقابة للحد من المواد النباتية إلى حجم الجسيمات بطريقة موحدة استنساخه. مرة واحدة على عينات من الأرض ، والروبوت الآلي التنسيق يوزع كميات محددة من المواد وسجلت في المقابل من الآبار بئر عميقة لوحة 96 (الشكل 1). عادة ، ونحن الاستغناء عن نفس المادة الى 4 آبار لدينا 4 يعيد للتحليل. مرة واحدة تملأ اللوحات مع المواد النباتية في التخطيط المطلوب ، يتم نقل يدويا لأنها محطة معالجة السائل (الشكل 2). في هذه المحطة التي يتعرض لها عينات إلى المعالجة إما خفيفة مع حمض مخفف أو القلوية وحضنت في درجة حرارة تصل إلى 90 درجة مئوية. بعد ذلك تتم إزالة الحل المعالجة وتشطف العينات مع عازلة لإعادتهم إلى درجة الحموضة مناسبة للالمائي. ثم يتم تحضين العينات مع مزيج الانزيم لفترة من الزمن المتغير عند 50 درجة مئوية. يؤخذ على قسامة من حلامة تلقائيا ، ونحن مصممون على خفض السكريات الأسلوب MBTH اللونية.
Protocol
1. تحضير عينات
نحن نعمل عادة مع نابع إما من النباتات العشبية أو الخشبية. في حالة المواد العشبية التي تزرع النباتات لمرحلة النضج ، وبعد تطوير البذور الجافة التي نجمعها ينبع الشيخوخة حالما يكتمل. ومقطعة الى شرائح ينبع 4 ملم ، ووضعها في قارورة 2 مل مع كرات طحن الثلاثة. في حالة المواد الخشبية ، هي الأرض العينات الى نشارة الخشب الخشنة مع مسار ملف الخشب ومن ثم وضعها في طاحونة الكرة لمزيد من المعالجة.
توضع العينات في رفوف داخل طحن / تنسيق محطة (الشكل 1). هذه المحطة يطحن بالتسلسل ، يمزج ، ويزن كل عينة. تم تأسيس عدد من التكرار المطلوبة لكل عينة عن طريق اختبار مواد الأرض في سلسلة من التجارب الأولية ، حيث يتم تحديد التباين الجوهرية لحجم الجسيمات معينة. واخترقت قارورة سعة 2 في القاع ، ويتم الاستغناء عن المواد التي اهتزاز القارورة أكثر من البئر المحدد. يتم التحكم في ذراع تهتز من ردود الفعل من رصيد يسمح لصرفها دقيقة من المسحوق. الروبوت يوزع 4 ملغ / جيد في التحليل القياسي وهناك حاجة إلى 4 التكرار في الحالات القصوى. هذا يسمح بتحليل عينات من النبات 20 / لوحة.
2. المعالجة
مرة واحدة يتم تنسيق العينات ، يتم تجهيزها لوحات 96 - جيدا من قبل نظام تداول الآلي السائل (الشكل 2). هنا يتم تنفيذ المعالجة خفيفة على المواد النباتية من خلال إضافة 350 ميليلتر من حمض أو حلول القلوية والتدفئة لوحة على كتلة تكييفها. لتجنب التبخر خلال التحليل ، وأغلقت 96 لوحات جيدا مع مات السيليكون. يمكن تعديل درجة الحرارة ووقت المعالجة وفقا للمواد التي تجري دراستها. درجة الحرارة القصوى ، مع ذلك ، هي 100 درجة مئوية. إجراء بديل لاختبار أشد المعالجة المسبقة هو يمهد للمعالجة المواد خارج الخط ، والقضاء على pretreatmet من العملية.
3. تحليل بالماء
- بعد المواد سابقة التجهيز ، والروبوت يزيل تلقائيا حل المعالجة ، ويغسل ، وجميع الآبار ، و 5 مرات مع 850 ميكرولتر 25 ملم مخزن خلات. يتم تنفيذ يشطف بها مضيفا العازلة في حل المعالجة ، وإزالة لاحقا 50 ٪ من حجم التداول الكلي بعد السماح للمواد الصلبة في العينة إلى تسوية. تم تعيين ذروة الطموح في نصف كتلة السائل لتجنب الشفط المواد الصلبة من قاع البئر ، وليس هناك خسارة ضئيلة من المواد الصلبة باستخدام هذا النهج. بعد هذه يغسل جيدا في درجة الحموضة 4.5 والمواد مستعد لالإنزيمية.
- يضاف خليط يحتوي على انزيم حل السليلوزات وhemicellulases بواسطة الروبوت. في كل بئر ، يتم الاستغناء عن 850 ميليلتر من مزيج الأنزيم ، وانتقل إلى لوحة حاضنة 50 درجة مئوية الهز. يتم تنفيذ التحلل القياسية لمدة 8 ساعات ، ولكن يمكن تكييف هذه المرة لغرض التجربة. التحميل انزيم القياسية المستخدمة في الأعشاب هو 7 FPU / غرام من المادة.
4. الكشف عن السكريات المختزلة
تم تنفيذ التصميم للحد من السكريات أفرج عنه بعد التحلل باستخدام تعديل 3 - 2 - الميثيل benzothiazolinone hydrozone (MTBH) الأسلوب 3. وقد تم اختيار MBTH والأسلوب الأكثر مناسبة لأنه كان أسهل لأتمتة وأقل عرضة للتداخل من المركبات مثل البروتينات. نحن تعديل هذه الطريقة شديدة الحساسية للاستخدام على منصة الروبوت بحيث يمكن قياسها كميا بدقة في تركيزات السكريات الموجودة في hydrolysates الكتلة الحيوية ، مع حجم النهائي من 250 ميكرولتر الذي هو مناسبة ل96 لوحة ضوئية قياسية أيضا. يتم تنفيذ كافة الخطوات التالية تلقائيا وتم تنفيذ ثلاثة قرارات مستقلة عن الحد من السكريات لكل فعل تسكر.
- لقد التقطت 30 ميكرولتر من حلامة من لوحة البئر العميق ومختلطة مع 45 ميكرولتر من 25 ملم خلات الصوديوم العازلة في صفيحة متجنب 96 PCR جيدا.
- تم إضافة 25 ميكرولتر من هيدروكسيد الصوديوم 1N و 50 ميكرولتر من محلول يحتوي على 0.43 ملغم / لتر و 0.14 MBTH DTT ملغ / مل.
- بعد خلط ، كانت ساخنة لوحة PCR عند 60 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة في thermocycler أو جهاز مشابه يسلم بالضبط نفس الكمية من الحرارة إلى جميع الآبار 96.
- ونقل ردود الفعل الناتجة إلى لوحة ضوئية.
- إضافة 100 ميكرولتر من كاشف المؤكسدة (0.2 ٪ FeNH4 (SO4) 2 ، حامض Sulfamic 0.2 ٪ و 0.1 ٪ حمض الهيدروكلوريك). تخلط جيدا وتترك لتطوير ما لا يقل عن 1 ساعة.
- يجب على كل لوحة تحتوي أيضا على مستوى ردود الفعل nmol 50 ، 100 و 150 nmol nmol الجلوكوز. قراءة في لوحات ضوئية 620 نانومتر.
5. ممثل النتائج :
وتعرض أمثلة على أنواع مختلفة من التحليلات في الشكل 3 و 4. تم الحصول على جميع النتائج باستخدام منصة الآلي. الشكل 3 إعادةويعرض زيادة في الحد من السكريات اصدره حضانات ح 8 من الحور الأرض مع كميات متزايدة من الانزيمات cellulolytic. الشكل 4 يقدم آثار الحمضية والقلوية المعالجة على عينات الحور. هيدروكسيد الصوديوم في المعالجة هي أكثر كفاءة من أن تضعف H2SO4 المعالجة في تسهيل الافراج عن السكريات خلال التحلل. وتقاس كمية من السكريات بعد التحلل النقصان عندما يتم تنفيذ المعالجة باستخدام تركيزات أعلى من هيدروكسيد الصوديوم 1M.
الشكل 1. محطة الروبوتية لطحن و 96 تنسيق جيد من الكتلة الحيوية
الشكل 2. محطة مناولة السائل لتحليل الإنتاجية العالية تسكر
الشكل 3. تأثير أحمال مختلفة على انزيم الافراج عن تخفيض حكمه السكر من عينات الحور
الشكل 4. تأثير المعالجة المسبقة المختلفة على عينات من الحور تسكر. السكريات ألف أفرج عنه بعد pretreament مع نسب مختلفة من H2SO4 عند 90 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة. السكريات باء أفرج عنه بعد المعالجة المسبقة هيدروكسيد الصوديوم في نفس درجة الحرارة والوقت من حمض المعالجة .
Disclosures
ليس لدينا شيء في الكشف عنها.
Acknowledgments
فإن الكتاب وأود أن أشكر Viksø نيلسن (Novozymes) للهدية من الانزيمات cellulolytic. وقد تم تمويل هذا العمل من قبل FP7 التجديد والمشاريع التي BBSRC BB/G016178 وBB/G016194.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Grinding & weighing robot | Labman Automation | ||
| 2 ml micro tube with caps | Sarstedt Ltd | 72.694 | |
| 5 mm stainless steel beads | Qiagen | 69989 | |
| 1.2ml Abgene square well storage plates | Fisher Scientific | TUL-050-050C | |
| Whatman cap mat for 96 square well plates | Fisher Scientific | 7704-0104 | |
| Liquid hanling robot | Tecan Group Ltd. | Freedom Evo 200 | |
| Sulphuric acid | Fisher Scientific | S/9231/PB17 | |
| Sodium hydroxide | Fisher Scientific | BPE359-500 | |
| Sodium acetate | Sigma-Aldrich | S8750-500G | |
| Acetic acid | Fisher Scientific | A/0420/PB17 | |
| Novozyme 188 | Novozyme | DCN00214 | |
| Celluclast 1.5L | Novozyme | CCN03122 | |
| 96 well PCR full skirt plates | Sarstedt Ltd | 72.1980.202 | |
| D-Glucose | Fisher Scientific | G/0450/53 | |
| 3-Methyl-2-benzothiazolinone hydrazone hydrochloride hydrate | Sigma-Aldrich | 129739-25G | |
| DL-dithiothreitol | Sigma-Aldrich | D9163-1G | |
| Corning microplate 96 well flat bottom | Fisher Scientific | TKT-521-050H | |
| Ammonium iron (III) sulfate dodecahydrate | Sigma-Aldrich | F1668-250G | |
| Sulfamic acid | Sigma-Aldrich | 242772-500G | |
| Hydrochloric acid | Fisher Scientific | 12462-0026 |
References
- Carpita, N. C. Structure and Biogenesis of the Cell Walls of Grasses. Annu Rev Plant Physiol Plant Mol Biol. 47, 445-476 (1996).
- Gomez, L. D., Steele-King, C. G., McQueen-Mason, S. J. Sustainable liquid biofuels from biomass: the writing's on the walls. New Phytol. 178, 473-485 (2008).
- Anthon, G. E., Barrett, D. M. Determination of reducing sugars with 3-methyl-2-benzothiazolinonehydrazone. Anal Biochem. 305, 287-289 (2002).
- Gomez, L. D., Whitehead, C., Barakate, A., Halpin, C., McQueen-Mason, S. J. Automated saccharification assay for determination of digestibility in plant materials. Biotechnol Biofuels. 3, 23-23 (2010).
