Summary
Une méthode simple et rapide pour déterminer le potentiel de saccharification d'un grand nombre d'échantillons de biomasse végétale est décrite. La plate-forme automatisée pour cette analyse implique la préparation de la biomasse végétale pour l'analyse des plaques à 96 puits et la performance subséquente de prétraitement, l'hydrolyse et la quantification des sucres libérés.
Abstract
Les polysaccharides qui forment la biomasse végétale lignocellulosique peut être décomposé pour produire une gamme de sucres qui pourra ensuite être utilisée pour établir une bioraffinerie. Ces matières premières constituerait une nouvelle plateforme industrielle, qui est à la fois durable et neutre en carbone, pour remplacer l'actuelle dépendance des combustibles fossiles. La réticence à la déconstruction observé dans les matières lignocellulosiques est produit par plusieurs propriétés intrinsèques des parois des cellules végétales. Cellulose cristalline est intégré dans les polysaccharides tels que la matrice xylanes et arabinoxylanes, et toute la structure est enveloppée par le polymère phénolique lignine, qui est aussi difficile à digérer 1. Afin d'améliorer la digestibilité des matières végétales, nous devons découvrir les principaux goulots d'étranglement pour la saccharification des parois cellulaires et mutant d'écran aussi, et les populations nicheuses d'évaluer la variabilité de la saccharification 2. Ces tâches nécessitent une approche à haut débit et ici, nous présentons une plate-forme d'analyse qui peut effectuer une analyse saccharification dans un format plaque de 96 puits. Cette plateforme a été développée pour permettre le dépistage de la digestibilité de lignocellulose uniquement d'importantes populations d'espèces végétales variées. Nous avons réduit les volumes de réaction pour le prétraitement doux, hydrolyse enzymatique partielle de sucre et de détermination, pour permettre à un grand nombre d'être évalués rapidement dans un système automatisé.
Cette plate-forme automatisée fonctionne avec des quantités milligramme de biomasse, effectuant broyage dans des conditions contrôlées pour réduire les matières végétales pour une taille de particules standard d'une manière reproductible. Une fois les échantillons sont broyés, le robot automatisé formatage dispense montants spécifiés et enregistré des matériaux dans les puits correspondants de plaque de 96 puits profonds (figure 1). Normalement, nous dispenser de la même matière en 4 puits pour avoir 4 répétitions pour l'analyse. Une fois les plaques sont remplis avec du matériel végétal dans les aménagements souhaités, ils sont déplacés manuellement à une station de traitement des liquides (figure 2). Dans cette station, les échantillons sont soumis à un prétraitement doux avec de l'acide dilué ou alcaline et incubés à des températures allant jusqu'à 90 ° C. La solution de prétraitement est ensuite retirée et les échantillons sont rincés avec du tampon pour les retourner à un pH adapté à l'hydrolyse. Les échantillons sont ensuite incubés avec un mélange d'enzymes pour une durée de temps variable à 50 ° C. Une aliquote est tirée de l'hydrolysat et les sucres réducteurs sont automatiquement déterminés par la méthode colorimétrique MBTH.
Protocol
1. Préparation des échantillons
Nous normalement travailler avec découle soit herbacées ou ligneuses. Dans le cas des matières herbacées nous cultivons les plantes à maturité, et après le développement des graines que nous recueillons tiges sèches fois la sénescence est terminée. Les tiges sont coupées en 4 segments mm et placés dans des flacons de 2 ml avec trois billes de broyage. Dans le cas de matières ligneuses, les échantillons sont broyés à la sciure grossière avec un fichier de bois de parcours et ensuite placé dans un broyeur à boulets pour un traitement ultérieur.
Les échantillons sont placés dans un rack dans le meulage / formatage station (Figure 1). Cette station broie de façon séquentielle, les mélanges, et pèse chaque échantillon. Le nombre de répétitions nécessaires par échantillon est établie par des tests du matériel au sol dans une série d'expériences préliminaires, où la variabilité intrinsèque d'une certaine taille de particules est déterminée. Les flacons de 2 ml sont percés à la base et les matériaux sont dispensés par les vibrations de la fiole sur le bien sélectionné. Le bras vibrant est contrôlé par une rétroaction de l'équilibre permettant la distribution précise de la poudre. Le robot distribue 4 mg / puits dans une analyse standard et 4 répétitions sont nécessaires dans la plupart des cas. Cela permet à 20 échantillons de plantes / plateau pour être analysés.
2. Prétraitement
Une fois les échantillons sont formatés, les plaques de 96 puits sont traitées par un système automatisé de manipulation des liquides (figure 2). Voici un prétraitement douce est effectuée sur les matières végétales en ajoutant 350 ul d'acide ou de solutions alcalines et chauffage de la plaque sur un bloc adapté. Pour éviter l'évaporation lors de l'analyse, la plaque de 96 puits sont scellés avec un mat en silicone. La température et l'heure du prétraitement peut être modifié en fonction des matériaux étudiés. La température maximale, cependant, est de 100 ° C. Une procédure alternative pour les tests plus sévères prétraitements est de prétraiter les matériaux hors ligne et d'éliminer les pretreatmet du processus.
3. L'hydrolyse
- Après les matériaux sont prétraités, le robot enlève automatiquement la solution de prétraitement, et les lavages, tous les puits, 5 fois avec 850 uL de tampon acétate 25 mM. Les rinçages sont effectués par addition de tampon à la solution de prétraitement, et ensuite retirer 50% du volume total après déduction des solides dans l'échantillon à régler. La hauteur de l'aspiration est fixé à la moitié de la masse liquide pour éviter l'aspiration des solides du fond du puits, il ya une perte négligeable de solides en utilisant cette approche. Après ces lavages, le pH dans le puits est de 4,5 et le matériel est prêt pour l'hydrolyse enzymatique.
- Un mélange d'enzymes contenant une solution de cellulases et hémicellulases est ajouté par le robot. Dans chaque puits, 850 ul de mélange d'enzymes est dispensé et la plaque est déplacé dans un 50 ° C incubateur agitateur. L'hydrolyse standard est effectuée pendant 8 h, mais cette fois peut être adapté à l'objectif de l'expérience. Le chargement enzyme standard utilisé pour les graminées est de 7 FPU / g de matière.
4. La détection des sucres réducteurs
Détermination des sucres réducteurs libérés après hydrolyse a été réalisée en utilisant une version modifiée du 3-méthyl-2-benzothiazolinone Hydrozone (MTBH) la méthode 3. MBTH a été sélectionnée comme la méthode la plus appropriée, car elle a été la plus facile à automatiser et les moins sensibles aux interférences provoquées par des composés tels que les protéines. Nous avons modifié cette méthode très sensible pour une utilisation sur la plate-forme robotique de sorte qu'il pouvait quantifier avec précision les sucres aux concentrations présentes dans les hydrolysats de biomasse, avec un volume final de 250 pi qui est approprié pour une optique standard 96 puits. Toutes les étapes ci-dessous sont effectuées automatiquement et de trois déterminations indépendantes de la réduction des sucres ont été réalisées pour chaque réaction de saccharification.
- 30 uL d'hydrolysat a été prise de la plaque de puits profonds et mélangés avec 45 ul de tampon de 25 mM d'acétate de sodium dans une jupe de PCR 96 puits.
- 25 uL de NaOH 1N et 50 ul d'une solution contenant 0,43 mg / ml MBTH et 0,14 mg / ml TNT ont été ajoutés.
- Après mélange, la plaque de PCR a été chauffé à 60 ° C pendant 20 min dans un thermocycleur ou d'un dispositif similaire qui offre exactement la même quantité de chaleur pour les 96 puits.
- La réaction résultante a été transférée à une plaque optique.
- Ajouter 100 pl de réactif oxydant (0,2% FeNH4 (SO4) 2, 0,2% d'acide sulfamique et de 0,1% HCl). Mélangez bien et laissez reposer pendant au moins 1 h.
- Chaque plaque doit également contenir les réactions standard de 50 nmol, 100 et 150 nmol de glucose nmol. Les plaques optiques sont lues à 620 nm.
5. Les résultats représentatifs:
Exemples de différents types d'analyses sont présentés dans la figure 3 et 4. Tous les résultats ont été obtenus en utilisant la plate-forme automatisée. La figure 3 représente la hausse des sucres réducteurs libérés par des incubations 8 h à partir du peuplier du sol avec des quantités croissantes d'enzymes cellulolytiques. La figure 4 présente les effets de l'acide et prétraitement alcalin sur des échantillons de peuplier. Le prétraitement NaOH est plus efficace que la dilution de H2SO4 prétraitement en vue de faciliter la libération des sucres pendant l'hydrolyse. La quantité de sucres mesurées après hydrolyse diminue lorsque le prétraitement est effectué en utilisant des concentrations de NaOH 1M supérieur.
Figure 1. Station robotique pour le broyage et la mise en forme 96 et de la biomasse
Figure 2. Station de traitement des liquides pour l'analyse de saccharification High Throughput
Figure 3. Effet des charges enzymatiques différentes sur la libération de réduire les équivalents de sucre à partir d'échantillons de peuplier
Figure 4. Effet de prétraitements différents sur la saccharification des échantillons de peuplier. Sucres A. libéré après pretreament avec différents pourcentages de H2SO4 à 90 ° C pendant 30 minutes. Sucres B. libéré après prétraitements NaOH à la même température et le temps que le prétraitement d'acide .
Disclosures
Nous n'avons rien à révéler.
Acknowledgments
Les auteurs tiennent à remercier un Viksø-Nielsen (Novozymes) pour le don de les enzymes cellulolytiques. Ce travail a été financé par le 7e PC RENOUVELLEMENT et par les projets et le BBSRC BB/G016178 BB/G016194.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Grinding & weighing robot | Labman Automation | ||
| 2 ml micro tube with caps | Sarstedt Ltd | 72.694 | |
| 5 mm stainless steel beads | Qiagen | 69989 | |
| 1.2ml Abgene square well storage plates | Fisher Scientific | TUL-050-050C | |
| Whatman cap mat for 96 square well plates | Fisher Scientific | 7704-0104 | |
| Liquid hanling robot | Tecan Group Ltd. | Freedom Evo 200 | |
| Sulphuric acid | Fisher Scientific | S/9231/PB17 | |
| Sodium hydroxide | Fisher Scientific | BPE359-500 | |
| Sodium acetate | Sigma-Aldrich | S8750-500G | |
| Acetic acid | Fisher Scientific | A/0420/PB17 | |
| Novozyme 188 | Novozyme | DCN00214 | |
| Celluclast 1.5L | Novozyme | CCN03122 | |
| 96 well PCR full skirt plates | Sarstedt Ltd | 72.1980.202 | |
| D-Glucose | Fisher Scientific | G/0450/53 | |
| 3-Methyl-2-benzothiazolinone hydrazone hydrochloride hydrate | Sigma-Aldrich | 129739-25G | |
| DL-dithiothreitol | Sigma-Aldrich | D9163-1G | |
| Corning microplate 96 well flat bottom | Fisher Scientific | TKT-521-050H | |
| Ammonium iron (III) sulfate dodecahydrate | Sigma-Aldrich | F1668-250G | |
| Sulfamic acid | Sigma-Aldrich | 242772-500G | |
| Hydrochloric acid | Fisher Scientific | 12462-0026 |
References
- Carpita, N. C. Structure and Biogenesis of the Cell Walls of Grasses. Annu Rev Plant Physiol Plant Mol Biol. 47, 445-476 (1996).
- Gomez, L. D., Steele-King, C. G., McQueen-Mason, S. J. Sustainable liquid biofuels from biomass: the writing's on the walls. New Phytol. 178, 473-485 (2008).
- Anthon, G. E., Barrett, D. M. Determination of reducing sugars with 3-methyl-2-benzothiazolinonehydrazone. Anal Biochem. 305, 287-289 (2002).
- Gomez, L. D., Whitehead, C., Barakate, A., Halpin, C., McQueen-Mason, S. J. Automated saccharification assay for determination of digestibility in plant materials. Biotechnol Biofuels. 3, 23-23 (2010).
