Summary
Een eenvoudige, snelle methode voor het bepalen van de versuikering potentieel van grote aantallen van plantaardige biomassa monsters is beschreven. De geautomatiseerde platform voor deze analyse heeft betrekking op de voorbereiding van de plantaardige biomassa voor analyse in platen met 96 putjes en de daaropvolgende prestaties van de voorbehandeling, hydrolyse en kwantificering van de vrijgekomen suikers.
Abstract
Polysacchariden die make-up plant lignocellulose biomassa kan worden onderverdeeld in een reeks van suikers die vervolgens kan worden gebruikt in de oprichting van een bioraffinage te produceren. Deze grondstoffen zou een nieuwe industriële platform, dat zowel duurzaam en klimaatneutraal, om de huidige afhankelijkheid van fossiele brandstoffen te vervangen. De weerspannigheid aan deconstructie waargenomen in lignocellulose materiaal wordt geproduceerd door een aantal intrinsieke eigenschappen van plantaardige celwanden. Kristallijne cellulose is ingebed in een matrix Polysacchariden zoals xylans en arabinoxylanen, en de hele structuur wordt ingekapseld door de fenolische polymeer lignine, dat is ook moeilijk te verteren 1. Om de verteerbaarheid van plantaardige materialen die we nodig hebben om de belangrijkste knelpunten voor de versuikering van de celwanden en ook het scherm mutant en populaties broedvogels te ontdekken aan de variabiliteit te evalueren in versuikering 2 te verbeteren. Deze taken vereisen een hoge doorvoer benadering en hier presenteren we een analytisch platform dat versuikering analyse kan uitvoeren in een 96-well plaat formaat. Dit platform is ontwikkeld om de screening van lignocellulose de verteerbaarheid van grote populaties uit uiteenlopende plantensoorten mogelijk te maken. We hebben teruggeschroefd de reactie volumes voor zachte voorbehandeling, partiële enzymatische hydrolyse en suiker vastberadenheid, zodat grote aantallen snel worden beoordeeld in een geautomatiseerd systeem.
Deze geautomatiseerde platform werkt met milligram hoeveelheden biomassa, het uitvoeren van een kogelmolen onder gecontroleerde omstandigheden om de plant materialen terug te brengen tot een gestandaardiseerde deeltjesgrootte in een reproduceerbare manier. Nadat de monsters zijn grond, de geautomatiseerde opmaak robot uitdeelt gespecificeerd en opgenomen hoeveelheden materiaal in de overeenkomstige putten van 96 diepe put plaat (figuur 1). Normaal gesproken, we afzien van hetzelfde materiaal in vier putten te hebben vier replica voor analyse. Zodra de platen zijn gevuld met het plantmateriaal in de gewenste lay-out, worden ze handmatig verplaatst naar een liquid handling station (figuur 2). In dit station worden de monsters onderworpen aan een milde voorbehandeling met ofwel verdund zuur of alkalische en geïncubeerd bij temperaturen tot 90 ° C. De voorbehandeling oplossing wordt vervolgens verwijderd en de monsters worden gespoeld met buffer om hen terug te gaan naar een geschikte pH voor hydrolyse. De monsters worden vervolgens geïncubeerd met een enzym mengsel voor een variabele lengte van de tijd bij 50 ° C. Een deel wordt overgenomen uit het hydrolysaat en de reducerende suikers worden automatisch bepaald door de MBTH colorimetrische methode.
Protocol
1. De voorbereiding van de monsters
Wij werken normaal gesproken met komt voort uit zowel kruidachtige of houtige gewassen. In het geval van kruidachtige materialen die we groeien de planten naar volwassenheid, en na het zaad ontwikkeling die we verzamelen droge stengels zodra senescence is voltooid. De stengels zijn gehakt in 4 mm segmenten en geplaatst in 2 ml flesjes met drie frezen ballen. In het geval van houtachtige materialen, worden de monsters grond om grof zaagsel met een cursus hout-bestand en vervolgens geplaatst in een kogelmolen voor verdere verwerking.
De monsters worden in een rack binnen het slijpen / opmaak station (figuur 1). Dit station maalt sequentieel, mixen, en weegt elk monster. Het aantal herhalingen nodig per monster wordt vastgesteld door het testen van de gemalen materiaal in een reeks van inleidende experimenten waarbij de intrinsieke variabiliteit voor een bepaalde deeltjesgrootte wordt bepaald. De 2 ml flacons worden doorboord aan de onderkant en de materialen worden verstrekt door trilling van de flacon over de geselecteerde goed. De trillende arm wordt bestuurd door een terugkoppeling van de balans waardoor de nauwkeurige dosering van het poeder. De robot verdeelt 4 mg / putje in een standaard analyse en 4 herhalingen nodig zijn in de meeste gevallen. Dit maakt 20 plant samples / plaat te worden geanalyseerd.
2. Voorbehandeling
Nadat de monsters zijn opgemaakt, zijn de 96-well platen verwerkt door een geautomatiseerd liquid handling systeem (figuur 2). Hier een milde voorbehandeling wordt uitgevoerd op de plantmateriaal door het toevoegen van 350 pi van zure of basische oplossingen en het verwarmen van de plaat op een aangepaste blok. Om te voorkomen dat de verdamping tijdens de analyse, worden de platen met 96 putjes afgesloten met een siliconen mat. De temperatuur en tijd van de voorbehandeling kan worden aangepast aan het materiaal dat wordt onderzocht. De maximum temperatuur is echter 100 ° C. Een alternatieve procedure voor het testen van hardere voorbehandelingen is om de materialen off-line voorbehandelen en de pretreatmet uit het proces te elimineren.
3. Hydrolyse
- Nadat de materialen zijn voorbehandeld, de robot verwijdert automatisch de voorbehandeling oplossing, en wast, al de putten, vijf keer met 850 pi 25 mM acetaatbuffer. De spoelingen worden uitgevoerd door het toevoegen van buffer om de voorbehandeling oplossing, en vervolgens het verwijderen van 50% van het totale volume na aftrek van de vaste stoffen in het monster te regelen. De hoogte van de aspiratie is vastgesteld op de helft van de vloeibare massa om te voorkomen dat aspiratie vaste stoffen uit de bodem van de put, er is verwaarloosbaar verlies van vaste stoffen met behulp van deze aanpak. Na deze wast de pH-waarde in de put is 4,5 en het materiaal is klaar voor enzymatische hydrolyse.
- Een enzym mengsel dat een oplossing van cellulasen en hemicellulasen wordt toegevoegd door de robot. In elke goed, is 850 ul van enzymmengsel afgegeven en de plaat wordt verplaatst naar een 50 ° C schudden incubator. De standaard hydrolyse wordt uitgevoerd voor acht uur, maar dit keer kan worden aangepast aan het doel van het experiment. De standaard enzym gebruikt voor het laden van grassen is 7 FPU / g van het materiaal.
4. Detectie van reducerende suikers
Bepaling van reducerende suikers vrijgelaten na hydrolyse werd uitgevoerd met behulp van een aangepaste 3-methyl-2-benzothiazolinone hydrozone (MTBH) methode 3. MBTH werd geselecteerd als de meest geschikte methode, want het was het makkelijkst te automatiseren en het minst gevoelig voor interferentie van verbindingen zoals eiwitten. We pasten deze zeer gevoelige methode voor het gebruik op de robot-platform, zodat het kon nauwkeurig kwantificeren suikers bij de concentraties aanwezig in de biomassa hydrolysaten, met een uiteindelijk volume van 250 ui die geschikt is voor een standaard optische 96 wells plaat. Al de onderstaande stappen worden automatisch uitgevoerd en drie onafhankelijke bepalingen van de reducerende suikers werden uitgevoerd voor elke versuikering reactie.
- 30 pi van het hydrolysaat werd genomen uit de diepe well plaat en gemengd met 45 pi van 25 mM natriumacetaat buffer in een skirted PCR-96 wells plaat.
- 25 pi van NaOH 1 N en 50 ul van een oplossing die 0,43 mg / ml MBTH en 0,14 mg / ml DTT werden toegevoegd.
- Na het mengen werd de PCR-plaat verwarmd bij 60 ° C gedurende 20 min in een thermocycler of soortgelijk apparaat dat exact dezelfde hoeveelheid warmte levert aan alle 96 wells.
- De resulterende reactie werd overgebracht naar een optische plaat.
- Voeg 100 pi van oxiderende reagens (0,2% FeNH4 (SO4) 2, 0,2% sulfaminezuur en 0,1% HCl). Meng goed en laat ontwikkelen voor minstens 1 uur
- Elke plaat moet ook bevatten standaard reacties van 50 nmol, 100 en 150 nmol nmol glucose. De optische platen worden afgelezen bij 620 nm.
5. Representatieve resultaten:
Voorbeelden van verschillende types van analyses zijn weergegeven in figuur 3 en 4. Alle resultaten werden verkregen met behulp van het geautomatiseerde platform. Figuur 3 representeert de toename van de reducerende suikers uitgebracht door 8 uur incubatie van de grond populier met toenemende hoeveelheden van cellulolytische enzymen. Figuur 4 toont het effect van zure en alkalische voorbehandeling op populier monsters. De NaOH voorbehandeling is efficiënter dat de verdunde H2SO4 voorbehandeling bij het faciliteren van het vrijkomen van suikers tijdens de hydrolyse. De hoeveelheid suikers gemeten na hydrolyse neemt af wanneer de voorbehandeling wordt uitgevoerd met behulp van NaOH concentraties hoger dan 1M.
Figuur 1. Robotic station voor het slijpen en 96 goed opmaak van biomassa
Figuur 2. Liquid handling station voor de High Throughput versuikering analyse
Figuur 3. Effect van verschillende enzym belasting over de vrijlating van reducerende suiker equivalenten van populier monsters
Figuur 4. Effect van verschillende voorbehandelingen op de versuikering van populieren monsters. A. Suikers vrijgelaten na pretreament met verschillende percentages van H2SO4 bij 90 ° C gedurende 30 minuten. Suikers B. vrijgelaten na NaOH voorbehandelingen bij dezelfde temperatuur en tijd dan het zuur voorbehandeling .
Disclosures
We hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
De auteurs willen graag een Viksø-Nielsen (Novozymes) bedanken voor de gave van de cellulolytische enzymen. Dit werk werd gefinancierd door KP7 VERNIEUWING en door BBSRC projecten BB/G016178 en BB/G016194.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Grinding & weighing robot | Labman Automation | ||
| 2 ml micro tube with caps | Sarstedt Ltd | 72.694 | |
| 5 mm stainless steel beads | Qiagen | 69989 | |
| 1.2ml Abgene square well storage plates | Fisher Scientific | TUL-050-050C | |
| Whatman cap mat for 96 square well plates | Fisher Scientific | 7704-0104 | |
| Liquid hanling robot | Tecan Group Ltd. | Freedom Evo 200 | |
| Sulphuric acid | Fisher Scientific | S/9231/PB17 | |
| Sodium hydroxide | Fisher Scientific | BPE359-500 | |
| Sodium acetate | Sigma-Aldrich | S8750-500G | |
| Acetic acid | Fisher Scientific | A/0420/PB17 | |
| Novozyme 188 | Novozyme | DCN00214 | |
| Celluclast 1.5L | Novozyme | CCN03122 | |
| 96 well PCR full skirt plates | Sarstedt Ltd | 72.1980.202 | |
| D-Glucose | Fisher Scientific | G/0450/53 | |
| 3-Methyl-2-benzothiazolinone hydrazone hydrochloride hydrate | Sigma-Aldrich | 129739-25G | |
| DL-dithiothreitol | Sigma-Aldrich | D9163-1G | |
| Corning microplate 96 well flat bottom | Fisher Scientific | TKT-521-050H | |
| Ammonium iron (III) sulfate dodecahydrate | Sigma-Aldrich | F1668-250G | |
| Sulfamic acid | Sigma-Aldrich | 242772-500G | |
| Hydrochloric acid | Fisher Scientific | 12462-0026 |
References
- Carpita, N. C. Structure and Biogenesis of the Cell Walls of Grasses. Annu Rev Plant Physiol Plant Mol Biol. 47, 445-476 (1996).
- Gomez, L. D., Steele-King, C. G., McQueen-Mason, S. J. Sustainable liquid biofuels from biomass: the writing's on the walls. New Phytol. 178, 473-485 (2008).
- Anthon, G. E., Barrett, D. M. Determination of reducing sugars with 3-methyl-2-benzothiazolinonehydrazone. Anal Biochem. 305, 287-289 (2002).
- Gomez, L. D., Whitehead, C., Barakate, A., Halpin, C., McQueen-Mason, S. J. Automated saccharification assay for determination of digestibility in plant materials. Biotechnol Biofuels. 3, 23-23 (2010).
