リグノセルロース系材料のためのハイスループット糖化アッセイ

Summary

植物バイオマスの大量のサンプルの糖化性を決定するためのシンプルな、迅速な方法が記載されている。この分析のための自動化されたプラットフォームは、96ウェルプレートおよび放出糖の前処理、加水分解と定量化のその後のパフォーマンスの分析のための植物バイオマスの準備を行います。

Abstract

植物リグノセルロース系バイオマスを構成する多糖類は、その後、バイオリファイナリーの確立に使用することができる糖の範囲を生成するために分解することができます。これらの原料が化石燃料の現在の依存関係を置き換えるために、持続可能でカーボンニュートラルでもある新たな産業プラットフォームを、構成するであろう。リグノセルロース系材料で観察された解体への反抗は、植物細胞壁のいくつかの固有の特性によって生成されます。結晶セルロースは、xylansとarabinoxylansとしてマトリックスの多糖類に埋め込 ​​まれており、全体の構造は^、1を消化することも困難であるフェノール系ポリマーリグニン、によって包み込まれているさ。我々は糖化²のばらつきを評価するための主な細胞壁の糖化のためのボトルネックとも画面の変異と繁殖個体群を発見するために必要な植物材料の消化率を向上させるために。これらのタスクは、高スループットのアプローチを必要とし、ここでは、96ウェルプレートフォーマットで糖化分析を実行できる分析プラットフォームを提示する。このプラットフォームは、多様な植物種からの大集団のリグノセルロースの消化率のスクリーニングを可能にするために開発されています。我々は、大規模な数値が自動化されたシステムで迅速に評価できるようにする、穏やかな前処理、部分的酵素加水分解と糖測定のための反応容量を縮小している。

この自動化されたプラットフォームでは、再現可能な方法で標準化された粒子サイズに植物材料を減らすために制御された条件下でボールミル粉砕を行う、バイオマスのミリグラム量で動作します。サンプルが地面になったら、自動化されたフォーマットのロボットは、96ディープウェルプレート（図1）の対応するウェルに物質の指定と記録された金額を分配する。通常は、我々は4が分析のために複製持つように4ウェルに同一の材料を分注する。プレートを、所望のレイアウトで植物の物質で満たされると、それらは手動で液体ハンドリングステーション（図2）に移動されます。このステーションではサンプルは希酸またはアルカリのどちらかで軽度の前処理に供されると90℃までの温度でインキュベートし前処理溶液は、その後削除され、サンプルは、加水分解に適したpHに戻すためのバッファで洗浄されています。次いで、試料を50時間の可変長のための酵素混合℃でインキュベートする。アリコートを加水分解物から取得され、還元糖は、自動的にMBTH比色法によって決定されます。

Protocol

1。サンプルの調製我々は、通常、草本や木本植物のいずれの茎で動作。草本材料の場合、我々は成熟して植物を栽培し、老化が完了すると種子の開発の後に我々は、乾燥茎を収集する。茎は、4 mmのセグメントに切断三粉砕用ボールで2mlバイアルに配置されます。木質材料の場合、サンプルはもちろんの木製のファイルと粗いおがくずに粉砕され、その後、さらなる処理のためにボールミルに投入。 試料は、粉砕/フォーマットするステーション（図1）内のラックに配置されます。この駅には順次、ミックスを磨く、および各サンプルの重量を量る。サンプルごとに必要な繰り返し回数が一定の粒​​子サイズのための本質的なばらつきが決定される予備的な一連の実験における地盤材料をテストすることによって確立されます。 2 mLバイアルは、下部に穴を開けていると材料が選択さをはるかに越えてバイアルの振動によって分配される。振動腕は粉体の正確な分注を可能にするバランスからのフィードバックによって制御されます。ロボットは、標準的な分析で4 mgの/ウェルと4回の繰り返しがほとんどのケースで必要とされる分注します。これは、20植物サンプル/プレートを分析することができます。 2。前処理サンプルがフォーマットされると、96ウェルプレートは、自動液体ハンドリングシステム（図2）によって処理されます。ここでは軽度の前処理は、酸またはアルカリ溶液350μLを追加し、適応ブロック上にプレートを加熱することにより、植物材料に実行されます。分析中に蒸発を避けるために、96ウェルプレートは、シリコンマットで密封されています。前処理の温度及び時間は、調査される材料に応じて変更することができます。最高温度は、しかしながら、100℃です。厳しい前処理をテストするための代替手順は、オフラインの材料を前処理し、プロセスからpretreatmetを排除することです。 3。加水分解材料を前処理したら、ロボットは自動的に前処理溶液、850μLの25 mM酢酸緩衝液で洗浄、すべてのウェル、5回を削除します。すすぎは、前処理溶液にバッファを追加し、続いてサンプル中の固形物を沈降させた後、総容積の50％を除去することによって行われている。吸引の高さは、井戸の底から固形物を吸引避けるために、液体の質量の半分に設定され、このアプローチを使用して固形物のごくわずかの損失があります。これらは洗浄後ものpHは4.5であり、材料は、酵素加水分解のための準備ができています。 セルラーゼおよびヘミセルラーゼのソリューションを含む酵素混合物はロボットによって追加されます。各ウェルに、酵素の混合物の850μL分注し、プレートを50℃の振盪インキュベーターに移動​​されます。標準的な加水分解は、8時間のために実行されますが、この時間は、実験の目的に適合させることができる。草のために使用される標準的な酵素の負荷は、材料の7 FPU / gである。 4。還元糖の検出加水分解後にリリースされた還元糖の定量は、修正された3 -メチル-2 -ベンゾチアゾリノンhydrozone（MTBH）方法3を用いて行った。それは自動化するための最も簡単で、タンパク質などの化合物からの干渉に少なくとも影響を受けていたためMBTHは、最​​も適切な方法として選択されまし​​た。我々は標準的な光学96ウェルプレートに適している250μLの最終体積で、それは正確にバイオマスの加水分解物中に存在する濃度で糖を定量化することができるように、ロボットプラットフォーム上で使用できるように、この高感度の方法を変更。以下のすべてのステップが自動的に実行され、還元糖の3つの独立した決定は、それぞれの糖化反応のために実施した。 加水分解物の30μlをディープウェルプレートから採取し、スカートPCRを96ウェルプレートの25 mM酢酸ナトリウム緩衝液の45μLと混合した。 1N NaOHを25μL、0.43 mg / mlのMBTH、0.14 mg / mlのDTTを含む溶液50μlを加えた。 混合した後、PCRプレートは60℃に加熱させたすべての96ウェルに熱の正確に同じ量を提供クラーまたは類似の装置で20分間。 得られた反応は、光学プレートに移した。 酸化試薬（0.2％FeNH4（SO4）2、0.2％スルファミン酸と0.1％塩酸）100μLを加える。よく混和して、少なくとも1時間の開発を残す 各プレートはまた、50 nmolの、100 nmolの、150 nmolのグルコースの標準的な反応が含まれている必要があります。光学プレートは620nmで読み取られます。 5。代表的な結果： 分析の様々なタイプの例を図3および4に示されている。すべての結果は、自動化されたプラットフォームを用いて得られた。図3再セルロース分解酵素の量が増加すると地上のポプラから8時間のインキュベーションによって解放還元糖の増加を示す。図4は、酸とポプラの試料のアルカリ前処理の効果を示す。 NaOHの前処理は、加水分解中の糖の放出を容易に希釈H2SO4前その方が効率的です。加水分解後に測定糖の量は、前処理が1M以上の水酸化ナトリウムの濃度を使用して実行されたときに減少します。 図1研削とバイオマスの96ウェルフォーマットのためのロボットステーションハイスループットの糖化の分析については、 図2。液体ハンドリングステーション 図3。ポプラのサンプルから糖当量を減らすのリリースで異なる酵素負荷量の影響酸の前処理に比べ、同じ温度と時間でのNaOH前処理の後にリリース90でH 2 SO 4の異なる割合でpretreament℃で30分間後にリリースされた図4。ポプラの試料の糖化に関するさまざまな前処理の効果。A.糖。B.糖 。

Discussion

Variations of the standard saccharification protocol can be used in the same platform for determining the activity of cellulolytic enzymes (i.e. by variation of the enzyme concentrations used in a plate as well as using paper as substrate); comparison of the efficiency of several enzyme mixtures on a specific material; time course for saccharification; etc.

A standard saccharification protocol to compare the saccharification potential in different plant materials involves an eight hour hydrolysis (Figures 3 and 4). Most of the plant materials analysed requires four replicates. Under these conditions, the platform can process 80 samples/day. This analysis is being used to screen large populations of barley, maize, and brachypodium in order to establish variability in saccharification potential and the genes involved in its determination⁴.

Materials

Name of the reagent	Company	Catalogue number
Grinding & weighing robot	Labman Automation
2 ml micro tube with caps	Sarstedt Ltd	72.694
5 mm stainless steel beads	Qiagen Ltd	69989
1.2ml Abgene square well storage plates	Fisher Scientific Ltd	TUL-050-050C
Whatman cap mat for 96 square well plates	Fisher Scientific Ltd	7704-0104
Liquid hanling robot	Tecan Group Ltd.	Freedom Evo 200
Sulphuric acid	Fisher Scientific Ltd	S/9231/PB17
Sodium hydroxide	Fisher Scientific Ltd	BPE359-500
Sodium acetate	Sigma-Aldrich	S8750-500G
Acetic acid	Fisher Scientific Ltd	A/0420/PB17
Novozyme 188	Novozyme	DCN00214
Celluclast 1.5L	Novozyme	CCN03122
96 well PCR full skirt plates	Sarstedt Ltd	72.1980.202
D-Glucose	Fisher Scientific Ltd	G/0450/53
3-Methyl-2-benzothiazolinone hydrazone hydrochloride hydrate	Sigma-Aldrich	129739-25G
DL-dithiothreitol	Sigma-Aldrich	D9163-1G
Corning microplate 96 well flat bottom	Fisher Scientific Ltd	TKT-521-050H
Ammonium iron (III) sulfate dodecahydrate	Sigma-Aldrich	F1668-250G
Sulfamic acid	Sigma-Aldrich	242772-500G
Hydrochloric acid	Fisher Scientific Ltd	12462-0026